核酸的性质及研究方法

核酸的性质及研究方法核酸的性质及研究方法第1页一核酸水解（糖苷键，磷酸二酯键）二核酸酸碱性质（磷酸基，碱基）三核酸紫外吸收（碱基）四核酸变性和复性（双螺旋结构）核酸的性质及研究方法第2页一核酸水解核酸的性质及研究方法第3页（一）酸水解：

•嘌呤碱与脱氧核糖之间糖苷键对酸最不稳定

•嘌呤碱糖苷键﹥嘧啶碱糖苷键﹥磷酸酯键（二）碱水解

•RNA磷酸酯键易被碱水解→2’-或3’-核苷酸

•DNA对碱稳定,因为没有2’-OH核酸的性质及研究方法第4页

碱水解2′-核苷酸3′-核苷酸混合物环磷酸酯核酸的性质及研究方法第5页（三）酶水解磷酸二酯酶（非特异性水解）核酸酶核糖核酸酶RNaseⅠ（特异性）RNaseT1RNaseT2

脱氧核糖核酸酶

DNaseⅠDNaseⅡ蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶核酸的性质及研究方法第6页蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶磷酸二酯酶（非专一性外切酶）识别5’末端识别5’-OH形成磷酸酯键产生3’核苷酸识别3’末端识别3’-OH形成磷酸酯键产生5’核苷酸核酸的性质及研究方法第7页蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶5‘3’核酸的性质及研究方法第8页1.核酸酶分类

(1)按底物专一性分类核糖核酸酶（ribonuclease,RNase）脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNase）(2)作用方式核酸内切酶（endonuclease）核酸外切酶（exonuclease）(3)按磷酸二酯键断裂方式识别3’-OH磷酸二酯键，产生5’-核苷酸识别5’-OH磷酸二酯键，产生3’-核苷酸(4)其它如双链酶、单链酶等核酸的性质及研究方法第9页2.核糖核酸酶类(1)牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease,简称RNaseA或RNase

I）

只作用RNA，不作用于DNA含有极高专一性内切酶作用位点：嘧啶核苷-3`-磷酸与其它核苷酸之间连接键。产物是3`嘧啶核苷酸结尾。核酸的性质及研究方法第10页(2)核糖核酸酶T1

（ribonucleaseT1，简称RNaseT1）

作用位点：3’G与其相邻核苷酸5-OH之间连键产物是3’G或者以3’G为末端寡核苷酸核酸的性质及研究方法第11页(3)核糖核酸酶T2

（ribonucleaseT2，简称RNaseT2）

A

U

C

G

AG

主要作用点为Ap残基，水解速度A>>U>G>C核酸的性质及研究方法第12页3.脱氧核糖核酸酶(1)牛胰脱氧核糖核酸酶

（pancreaticdeoxyribonuclease，简称DNaseI）作用位点：双链DNA或者单链DNA，产生5’P为末端寡聚核苷酸，平均长度4nt，需要Mg2+、Co2+、Mn2+激活最适pH值7-8。核酸的性质及研究方法第13页(2)牛脾脱氧核糖核酸酶

（spleendeoxyribonuclease,简称DNaseII）作用位点：作用于DNA产生3’P为末端寡聚核苷酸，平均长度6nt需要Na2+激活,而Mg2+抑制酶活，最适pH值4-5。核酸的性质及研究方法第14页(3)限制性内切酶（restrictionendonuclease）

简称限制酶

限制性内切酶主要降解外源未经特殊修饰DNA，对本身起了保护作用，含有严格碱基序列专一性。限制性内切酶已成为基因工程主要工具酶

核酸的性质及研究方法第15页限制性内切酶特征①含有严格碱基专一性，有专一识别次序、切点②形成产物含有粘性末端或者平整末端核酸的性质及研究方法第16页核酸的性质及研究方法第17页限制性内切酶命名EcoRI

E为大肠杆菌E.coli属名第一个字母，第2、3个字母co为它种名头两个字母，第四个R表示所用大肠杆菌菌株，最终一个罗马字表示该菌中已分离出这一类酶编号。HindⅢ流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）核酸的性质及研究方法第18页限制性内切酶举例核酸的性质及研究方法第19页核酸的性质及研究方法第20页1碱基与核苷解离：

•

碱基解离：碱基中杂环分子中N以及各取代基含有结合时释放质子能力，现有碱性解离又有酸性解离核苷：核糖环存在增强了碱基酸性解离

二、核酸酸碱性质核酸的性质及研究方法第21页

碱基解离核酸的性质及研究方法第22页核酸的性质及研究方法第23页因为磷酸基存在，是核苷酸含有较强酸性OOOHOHPROOOHO-PROOO-O-PRpK1=0.7~1.6pK2=5.9~6.5核酸的性质及研究方法第24页4种核苷酸解离曲线

核酸的性质及研究方法第25页胞嘧啶核苷酸解离核酸的性质及研究方法第26页5种核苷酸解离常数(pKa)和等电点(pI)-------------------------------------------------------------------------------------------

磷酸基第一次含氮环磷酸基第二次含氮环-NH-pI

羟基解离=N+H-羟基解离（烯醇式羟基）

(pKa1)(pKa2)(pKa3)(pKa4)-----------------------------------------------------------------AMP0.93.8(N1)6.2-2.35GMP0.72.4(N7)6.19.4(N1)1.55CMP0.84.5(N3)6.3-2.65UMP1.0-6.49.5(N3)-TMP~1.6-6.510.0(N3)------------------------------------------------------------------可用离子交换层析或电泳分离和判定核苷酸核酸的性质及研究方法第27页三核酸紫外吸收:max=260nm核酸的性质及研究方法第28页1.DNA或RNA定量测定OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0OD260应用核酸的性质及研究方法第29页3测定核酸

(p)

可判断DNA制剂是否发生变性或降解。

(p):摩尔磷吸光系数

(p)=A/cL

核苷酸﹥单链﹥双螺旋；RNA﹥DNA

•核酸的性质及研究方法第30页增色效应(hyperchromiceffect)：

单链多核苷酸

(p)

比双螺旋结构(p)高，所以核酸发生变性后，

(p)

升高约25%，此现象称为增色效应变性DNA复性后，

(p)

又降低，这种现象称为减色效应核酸的性质及研究方法第31页四、核酸变性、复性及杂交（一）变性定义：在一些理化原因作用下，核酸双螺旋区氢键断裂，使变成单链，并不包括共价键断裂过程。原因：酸，碱：酸碱变性加热：热变性变性试剂如尿素、甲醛等。核酸的性质及研究方法第32页DNA变性本质是双链间氢键断裂核酸的性质及研究方法第33页例：变性引发紫外吸收值改变DNA紫外吸收光谱核酸的性质及研究方法第34页Tm：DNA变性作用发生在一个相当窄温度范围内，有一个相变过程。通常把加热变性使DNA双螺旋结构失去二分之一时温称为DNA熔解温度(Tm)。变性特点：暴发式核酸的性质及研究方法第35页TmTm影响Tm值原因（1）DNA均一性核酸的性质及研究方法第36页（2）介质中离子强度（3）G-C含量影响核酸的性质及研究方法第37页（二）DNA复性

DNA复性(renaturation)定义在适当条件下，变性DNA两条彼此分开链可重新缔合成为双螺旋构象，这一过程称为复性。热变性DNA经迟缓冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。核酸的性质及研究方法第38页DNA复性核酸的性质及研究方法第39页复性动力学★热变性DNA在迟缓冷却时能够复性退火温度＝Tm－25℃

，快速冷却不能复性（淬灭）。★DNA片段越大，复性越慢；★DNA浓度越大，复性越快。★两种浓度相同，不过起源不一样DNA，复性时间长短与基因组大小相关，含有很多重复序列DNA，复性快核酸的性质及研究方法第40页

将不一样起源DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在一些区域含有相同序列，则复性时，会形成杂交DNA分子。杂交也发生在DNA和RNA之间（三）分子杂交与探针技术核酸的性质及研究方法第41页Southernblotting：DNA印迹术:DNA-DNA杂交Northernblotting：RNA印迹术研究对象为mRNA,探针普通为DNAWesternblotting：蛋白质印迹术:研究对象为蛋白质，抗原-抗体结合

常见核酸分子杂交技术核酸的性质及研究方法第42页核酸的性质及研究方法第43页第14章

核酸研究方法核酸分离、提纯与定量核酸超速离心核酸凝胶电泳序列测定DNA聚合酶链反应（PCR）核酸的性质及研究方法第44页琼脂糖凝胶电泳

天然琼脂(agar)是一个多聚糖，主要由琼脂糖(agarose，约占80％)及琼脂胶(agaropectin)组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物组成中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一个含硫酸根和羧基强酸性多糖，因为这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强电渗现象。一、支持物：琼脂糖凝胶核酸的性质及研究方法第45页①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不须事先处理就可进行电泳。②琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，所以电泳图谱清楚，分辨率高。优点核酸的性质及研究方法第46页④电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长久保留。③琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。核酸的性质及研究方法第47页琼脂糖凝胶电泳对核酸分离作用二、DNA琼脂糖凝胶电泳依据：DNA相对分子质量分子构型凝胶浓度电压核酸的性质及研究方法第48页在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对对数成反比，所以经过已知大小标准物移动距离与未知片段移动距离进行比较，便可测出未知片段大小。1．核酸分子大小核酸的性质及研究方法第49页不一样大小DNA需要用不一样浓度琼脂糖凝胶进行电泳分离。2．琼脂糖浓度

核酸的性质及研究方法第50页1、凝胶类型琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。当前更多用是水平型，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又能够依据需要制备不一样规格凝胶板，节约凝胶，因而受到大家欢迎。三、电泳操作核酸的性质及研究方法第51页2、缓冲液系统

常见电泳缓冲液有：EDTA(pH8.0)＋Tris-乙酸(TAE)Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等核酸的性质及研究方法第52页3．电泳方法（1）凝胶制备

以稀释电极缓冲液为溶剂，用沸水浴配制一定浓度溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却约30min。核酸的性质及研究方法第53页（2）样品配制与加样

DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有O.25％溴酚蓝指示染料，含有10％～15％蔗糖或5％～10％甘油，以增加其比重，使样品集中。溴酚蓝是带有负电荷小分子有色物质，用于监测电泳行进过程核酸的性质及研究方法第54页（3）电泳

琼脂糖凝胶分离大分子DNA试验条件研究结果表明：在低浓度、低电压下，分离效果很好。在低电压条件下，线性DNA分子电泳迁移率与所用电压呈正比。不过，在电场强度增加时，较大DNA片段迁移率增加相对较小。所以伴随电压增高，电泳分辨率反而下降，为了取得电泳分离DNA片段最大分辨率，电场强度不宜高于5V／cm。核酸的性质及研究方法第55页(4)染色和拍照

常见荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行相关数据分析。核酸的性质及研究方法第56页ＤＮＡ聚合酶链反应（ＰＣＲ）核酸的性质及研究方法第57页生物样品DNA片段基因诊疗基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……核酸的性质及研究方法第58页基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段核酸的性质及研究方法第59页94℃55℃37℃核酸的性质及研究方法第60页Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020核酸的性质及研究方法第61页72℃94℃55℃PCR循环核酸的性质及研究方法第62页PCR基础原理PCR反应条件PCR过程PCR特点标准PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L核酸的性质及研究方法第63页PCR基础原理PCR反应条件PCR过程PCR特点核酸的性质及研究方法第64页PCR基础原理PCR反应条件PCR过程PCR特点核酸的性质及研究方法第65页1234522557294时间（min）温度（℃）PCR基础原理PCR反应条件PCR过程PCR特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目标DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍核酸的性质及研究方法第66页PCR基础原理PCR反应条件PCR过程PCR特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3