生化技术原理 第一章+生命大分子物质的制备

第一章生命大分子物质的制备主讲：苏应娟教授

生命大分子物质——通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢时所产生的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物。

问题：

如何获得纯的和比较纯的生命大分子物质？

1）材料的选择与处理2）测定方法的确立3）有效成分的抽提4）粗品的纯化和纯品的鉴定制备的一般过程第一节材料的选择有效成分——是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质杂质——有效成分以外的其它物质1）有效成分含量多2）稳定性好3）来源丰富4）保持新鲜5）提取工艺简单6）有综合利用价值材料选择应遵循的原则二、材料的处理

根据常用的动物、植物和微生物材料的特点各异，所以材料处理的要求也不同。1.动物脏器（1）冰冻动物：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，冲洗干净

-10℃冰库可短期保存

-70℃低温冰箱长期贮存1）人工剥去脏器外的脂肪组织；2）浸泡在脂溶性的有机溶剂（如丙酮、乙醚）中脱脂；3）采用快速加热（500℃左右）、快速冷却的方法、使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去；4）利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。对含有较多脂肪的脏器需要脱脂，一般脱脂的方法（2）干燥对于像脑下垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用对于含耐高温有效成分（如肝素）的肠粘膜，可在沸水中蒸煮处理，烘干后能长期保存

2.植物组织（1）若是叶片，用水洗净即可使用，或在10小时内置-4℃—-30℃冰箱贮藏备用；（2）若是植物种子，则须泡胀或粉碎才可使用。如材料含油脂较多时，也要进行脱脂处理。3.微生物特点：种类多、繁殖快、培养简便、诱变容易和不受季节影响培养液收集上清菌体有效成分有效成分（低温下短时间储存）（干粉，4℃保存）第二节确定测定方法问题：1.此物质在哪些材料中含有？2.哪些材料中含量较丰富？3.所用的纯化方案是否合适？目的：确定专一、准确、灵敏和简便的测定方法二、常用的测定方法1.光谱法优点：所用样品量较少，操作简单，反应迅速、灵敏，结果也较准确。适用：蛋白质的含量测定。

当一种酶反应的底物或产物有一个明显的吸收光谱时，可以借助测定发色团的产生和消失来确定酶存在的数量。（1）吸收光谱法（2）荧光法优点：精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。当分析物含量低、用吸收光谱法不能检测时，改用荧光分析法却能求得满意结果。

极稀的悬浮液采用此法测定，即测定悬浮液在不被吸收的波长下的消光值。此法用于测定细菌生长的浓度（A600nm）。（3）浊度法2．电化学法有些反应过程会放出质子氢（H+），可用灵敏的pH计或NaOH溶液滴定等方法追踪其变化，从而计算出欲测物的含量或活力。例如，葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定该酸的含量，使可求出葡萄糖氧化酶的活力。3．生物活性检测法大多数生命物质，尤其是一些激素类物质，当把它们注射入动物的特定器官时，所属机体将发生相应的变化，并且二者间有一定的相关性，即可对生命活性物质进行检测。如人绒毛膜促性腺激素（HCG）能使小鼠子宫迅速增值，通过测小鼠子宫的变化，就可推测出HCG的生理活性。4.免疫分析法

采用抗体与抗原之间发生的特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，就可对有关物质进行灵敏的定性或／和定量分析。

5．生物传感器

用生物传感器中的敏感膜与待测溶液中的某一物质进行反应，即可通过显示器反映出有效成分的数量。第三节

细胞的破碎

欲提取存在于细胞内的物质时，必须把细胞破碎。动物——细胞膜较脆弱极易破损，在组织绞碎或提取时就破坏了。植物和微生物——细胞壁较牢固，需要在提取前进行专门的破细胞操作。

一、机械破碎1．研磨法1）用研磨棒研碎组织，可加入一定量的石英砂（45-50μm）。2）匀浆器处理优点：较温和，适宜实验室应用注意：加石英砂时，对有效成分有吸附作用细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法2．组织捣碎器法剧烈的破碎细胞方法。在转速8000-10000r／min下处理30-45秒，细胞能完全破碎。注意：

1）加入石英砂；

2）必须保持低温，以防温度升高引起有效成分变性；

3）时间不易太长。3.超声波法它是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。加石英砂则可缩短时间。为防止产生过多的热量，用间歇处理和降低温度的方法。

4．压榨法此法是一种温和、彻底破碎细胞的方法。用1.77×108-3.54×108Pa的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔（＜细胞直径的孔），致使其被挤破、压碎。

5．冻融法

将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。

二、溶胀和自溶1.溶胀细胞膜为天然的半透膜，低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。例如，红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。2.自溶细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。特别小心操作，水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，也可把有效成分在自溶时分解。三、化学处理

用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（SDS）处理细胞时，可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类等物质，并导致整个细胞破碎。四、生物酶降解生物酶（如溶菌酶）有降解细菌细胞壁的功能。用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。例如，从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用加溶菌酶（来自蛋清）破细胞壁的步骤。第四节抽提

指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。

1.可用缓冲液，或稀酸、稀碱、有机溶剂（如丙酮、乙醇）等溶液抽提

2.还可用蒸馏水抽提一般理想的抽提溶液应具备的条件1）对有效成分溶解度大，破坏作用小；2）对杂质不溶解或溶解度很小；3）来源广泛、价格低廉、操作安全等。二、抽提有效成分的影响因子1.pH值2.金属离子3.溶剂的浓度4.极性

1．pH值

对具有等电点的两性电解质物质，抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提；酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提；用调至一定pH值的有机溶剂抽提。注意调pH值时，注意搅拌，避免局部出现过高的酸、碱浓度，导致所需物质变性有些抽提过程的最适pH值与使有效成分的活性稳定的pH值并不一致2.溶剂的极性和离子强度有些蛋白质或酶在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。增加蔗糖或甘油的浓度二甲基亚砜或二甲基甲酰胺使溶液的极性大大降低降低极性的方法提高溶液的离子强度

在水溶液中加入中性盐如KCl、NaCl、NH4Cl和(NH4)2SO4一般而言：离子强度较低的中性盐溶液促进蛋白质溶解，保护蛋白质活性的作用。离子强度过高则引起蛋白质发生盐析作用。常用的盐溶液是NaCl溶液，浓度以0.15mo1/L为宜。为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞器的分离，则宜用高浓度（0.5-2.0mo1/L）的盐溶液。粘多糖类物质也溶于高离子强度的盐溶液。若用有机溶剂抽提蛋白质等物质时，加入少量的中性盐也可使其稳定。用高浓度盐溶液的抽提物上层析柱时，一定要将盐除去。

3.水解酶—自身存在

这些酶在合适的条件下，与欲抽提的蛋白质或核酸发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。使这些酶丧失活性：加入抑制剂（苯甲基磺酰氟化物，简称PMSF）调节抽提液的pH、离子浓度或极性等

4．温度蛋白质或酶在低温（如0℃左右）最稳定。如，在生产人绒毛膜促性腺激素（HCG）制品时，一定要在低温下进行。从鸟肝分离出的丙酮酸羧化酶正好相反。它对低温敏感，25℃时才稳定。5．搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，致某些酶类变性失活6．氧化

蛋白质都含有必须的巯基，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶（或蛋白质）失活（或变性）。1)β-巯基乙醇（1-5mmol/L）2）半胱氨酸（5-20mmo1/L）3）还原谷胱甘肽4）巯基乙酸盐（1-5mmo1/L）等还原剂可以防止巯基发生氧化作用，或者延缓某些酶活性的丧失。

在抽提液中加入植物组织或微生物——酚类化合物当细胞破裂时，它可在多酚氧化酶的作用下转变为醌类物质，使抽提液的颜色由无色变为棕褐色，严重影响了有效成分的提取。加10％苯基硫脲或3×10-3mol/L聚乙烯吡珞烷酮或者是前面提到的还原剂，即可防止这一现象的发生。

7．金属离子巯基还能和来源于制备缓冲液的试剂中的金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。解决的办法：①用无离子水或重蒸水配制试剂②在配制的试剂中加1-3mmo1/LEDTA（金属离子络合剂）8．抽提液与抽提物的比例抽提液与抽提物的比例要适当，一般以5:1为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。第五节浓缩抽提液的体积若比较大，应先进行浓缩处理。一、沉淀法加入适量的中性盐，如[(NH4)2SO4]或有机溶剂，使有效成分变为沉淀。经离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，再经离心除去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。

二、吸附法加干葡聚糖凝胶G25到抽提液，两者比例为1:5。抽提液的体积可缩小三倍左右，回收蛋白质量约80％。当凝胶对有效成分吸附力强或吸水后对有效成分的性质有影响时，不宜采用。三、超过滤法

把抽提液装入超过滤装置，在空气或氮气（5.05×105Pa）压力下，使小分子物质（包括水分）通过半透膜（如硝酸纤维素膜），大分子物质留在膜内。用此法在12小时内可使50毫升样品浓缩到5毫升。超过滤—除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液四、透析浓缩法

把装抽提液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇（polyetheyleneglycol，分子量20000以上，简称PEG）或甘油中，10毫升抽提液可在1小时内浓缩到几乎无水的程度。透析——只用于除盐类和小分子杂质

五、减压蒸馏浓缩法

将抽提液装入减压蒸馏器的圆底烧瓶中，在减压真空状态下进行蒸馏。当真空度较高时，溶液的沸点可控制在30℃以下。这种方法一般适用于常温下稳定性好的物质。

六、冰冻干燥法冰冻的抽提液在真空状态下，可以由固体直接变为气体。有效成分不会破坏。冻干机主要由低温干燥箱、真空泵和冷冻机构成。在冻干小体积样品时，可以将其置玻璃真空干燥器中进行。具体作法：把分装至小瓶中的样品冰冻后放入装有五氧化二磷或硅胶吸水剂的真空干燥器中，连续抽真空使其达到浓缩、干燥状态。第六节纯化方案的设计与评价纯化方案——指在纯化过程中几种纯化方法有机的联合应用的总称。它是成功地达到纯化目的的前提。纯化方案合理，就能事半功倍。一、纯化方案的设计1.选择纯化方法依据：抽提液中有效成分和杂质之间理化性质的差异性沉淀法—溶解度的差异离子交换层析法—电荷差异凝胶过滤法—分子量差异亲和层析—配体亲和力差异2.可选择多种纯化方案时，纯化方法的排布应遵循的原则1）先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理的方法。2）精确、费时间和需样品量少的方法应当后选用。注意：一个纯化方案中，切忌一种方法重复使用。否则，不但不能提高纯化倍数，反而会降低回收率。

二、纯化方案的评价是对组成纯化方案的每一个纯化方法的评价。对纯化过程的每一步收集的溶液都进行有效成分的含量测定，并将比活力（活力单位数/毫克蛋白）、纯化倍数（每步的比活力/抽提液的比活力）和回收率（每步总比活力/抽提液的总活力×100%