生物学过程分子生物学

生物学过程分子生物学第1页/共74页6A

基因组与基因组学二十世纪人类科技史上产生了三大划时代创举：40年代第一颗原子弹爆炸、50年代人类首次登上月球、90年代人类基因组计划实施。后者以10年光阴、30亿美元的代价，测定了人类全套遗传物质30亿对碱基的排列顺序。DNA双螺旋结构的发现者、美国国家卫生研究院（NIH）的J.D.Watson博士1990年在《Science》上撰文指出，与阿波罗登月计划相比，虽然人类基因组计划的资金投入少，但它对人类生活的影响却可能更深远。事实正是如此，人类基因组计划实施的二十几年来，生命科学的研究与应用发生了翻天覆地的变化，以基因组学为核心的各种组学学科应运而生。第2页/共74页6A

基因组与基因组学基因组学是研究生物体基因组结构和功能的学科。其中：a基因组与基因组学的基本概念基因组学（Genomics）对基因组物理结构进行测序和分析的研究，称为结构基因组学；整体水平上阐明各基因生物功能的研究，称为功能基因组学，又称为后基因组学。基因组（Genome）一种生物全部基因（包括染色体、细胞器中所含的全套遗传物质）的集合称为该生物的基因组。第3页/共74页6A

基因组与基因组学b基因组学的学科体系研究物种研究层次环境表观比较功能结构病毒细菌真菌植物动物人类药物营养毒理神经疾病研究因子化学进化寄生于人体内的细菌种群：宏基因组学未改变基因组序列但显示功能改变第4页/共74页6A

基因组与基因组学c基因组学的主要研究方式基因组学的主要研究方式是启动并实施各种生物的基因组计划。基因组计划的主要工作任务是绘制各种图谱。遗传图谱物理图谱序列图谱基因图谱转录图谱表达图谱功能图谱进化图谱基因组学蛋白质组学转录组学代谢组学第5页/共74页各种生物体蛋白质的时空特异性表达谱制作；各种生物体蛋白质的结构与构象分析；各种生物体蛋白质之间的相互作用谱制作。各种生物体蛋白质的结构与功能的关系研究；蛋白质组学（proteomics）的研究内容第6页/共74页基于酵母双杂交技术的蛋白质之间相互作用探测程序Y2H转录启动DBADDBAD基因应答元件启动子报告基因诱饵蛋白筛查蛋白基因文库第7页/共74页基于蛋白片段互补技术的蛋白质之间相互作用探测程序PCA酵母MAT-a单倍体细胞酵母MAT-a单倍体细胞aa交配氨甲喋呤平板氨甲喋呤平板二氢叶酸还原酶F1-2片段二氢叶酸还原酶F3片段诱饵蛋白筛查蛋白a-aa-a第8页/共74页蛋白质之间相互作用图谱的制作与分析酵母芽颈生长过程酵母自我吞噬过程第9页/共74页基于免疫共沉淀技术的蛋白质-DNA相互作用探测程序ChIP转录调控因子组蛋白细胞核内破碎细胞DNAase处理转录调控因子特异性抗体免疫共沉淀释放克隆测序筛查到98个p53的新结合位点第10页/共74页6A

基因组与基因组学d基因组学的研究进展截止到2004年9月，已有205种生物的基因组完成测序，其中包括：真核生物19种；原核生物167种；古细菌19种。另外，还有更多种类的生物体已完成基因组草图甚至部分测序，如：牛、羊、猪、狗、猫、鸡、青蛙、海胆、蜜蜂、疟蚊、蕃茄、苜蓿、燕麦、大麦、小麦、玉米、高梁、大豆等，微生物更是不不计其数。截止到2006年底，基因组完成测序的生物累计已达1600余种。

从2010年起，国际上又启动了千人基因组计划。截止到2010年底，基因组完成测序的生物累计已达近5000种。第11页/共74页6A

基因组与基因组学e人类基因组的基本特征人类基因组的大小噬菌体大肠杆菌酵母拟南芥线虫果蝇水稻老鼠人类玉米小麦百合阿米巴虫2.0x105bp6.0x1011bp4.2x106bp1.0x107bp1.5x107bp1.0x108bp1.7x108bp4.3x108bp3.0x109bp3.3x109bp5.4x109bp1.6x1010bp5.0x1010bp第12页/共74页6A

基因组与基因组学e人类基因组的基本特征人类基因组的结构人类基因组中含有大量的重复顺序和高度重复顺序，非重复顺序只占总基因组的大约54-58%。例如，tRNA和rRNA编码基因在人染色体DNA上的拷贝数分别为：18S/28SrRNA编码基因5SrRNA编码基因tRNA编码基因28020001300第13页/共74页6A

基因组与基因组学e人类基因组的基本特征人类基因组的性质人体基因总数约为2.5万个95%以上的基因含有内含子结构每个基因的平均外显子数为7个基因的平均长度为16.3kbmRNA的平均长度为2.2kb第14页/共74页6B

基因组图谱的制作

基因组的遗传和物理图谱的制作有助于基因组的克隆与测序，它可以帮助人们将全套基因组以路标的形式分割成小片段，进行基因克隆、测序和鉴定，即所谓的top-down战略；如果将基因组DNA随机打断成片段，全部测序后，依据序列重叠性重新拼在一起，完成整条染色体上的DNA排列顺序，这就是所谓的bottom-up战略。基因组图谱主要有四种，即遗传图谱、物理图谱、功能图谱、转录图谱。遗传图谱是染色体的定性路标，而物理图谱则是定量路标。第15页/共74页6B

基因组图谱的制作a遗传图谱与物理图谱的基本概念遗传图谱又称连锁图谱，是指基因或DNA标记在染色体上的相对位置与遗传距离，后者通常以基因或DNA标记在染色体重组交换过程中的分离频率厘摩（cM）表示。cM值越大，两者之间距离越远。遗传图谱制作时所涉及基因或DNA标记越多，越密集，所得到的遗传图谱的分辨率也就越高。基因组的遗传图谱第16页/共74页6B

基因组图谱的制作a遗传图谱与物理图谱的基本概念物理图谱是指基因或DNA标记在染色体上的实际排列顺序位置，通常以已知核苷酸序列的DNA片段（如：序列标签位点，sequence-taggedsite，STS；或限制性内切酶识别位点）为“路标”，以碱基对（bp、kb、Mb）作为基本测量单位（图距），对基因组进行作图。基因组的物理图谱第17页/共74页6B

基因组图谱的制作生物体内的DNA和染色体普遍存在着同源重组现象。同源重组的频率首先取决于两条染色体或DNA双链的同源性程度；在相同的同源性情况下，重组频率又取决于两遗传位点（或基因之间的）距离，相b利用遗传重组法绘制遗传图谱距越远重组频率越高。就人体而言，在授精卵细胞中共有23对染色体，每对染色体的一条来自精细胞，另一条来自卵细胞。每对中的两条染色体互为同源染色体，相对应的基因称为等位基因。同源染色体在授精之后胚胎发育之前，会发生同源重组。第18页/共74页遗传同源重组机制Aa、Gg等互为等位基因，如果它们两两之间不是100%同源，那么经同源重组后，g等就不再与a等同存（连锁）于一条染色体上，它们将出现于不同的子代个体中，并表现出不同的性状，即孟德尔遗传规律。根据两个性状在第ABCDEFGHIJabcdefghijABCDEfghijabcdeFGHIJ重组ABCDEFGHIJabcdefghijABCDEfghijabcdeFGHIJ分离交配分离交配三代中的分离连锁频率，即可知道其重组频率。重组频率愈高的两个性状，其基因位点在原来亲本染色体上的距离也就越远。通过多对性状的比较，即可测定其基因位点的前后相对排列顺序。上世纪初，摩尔根和他的研究生就是用这种方法研究果蝇的遗传图谱的，到1915年，他们在果蝇染色体上已排定了85个遗传位点的顺序。第19页/共74页6B

基因组图谱的制作人细胞与啮齿类动物细胞通过细胞融合技术可形成杂合细胞。在这种杂合细胞中，人染色体会随着杂合细胞的增殖分裂而逐渐丢失，并可分离到含有单一人染色体的杂合细胞。该细胞本质上是鼠的，含有正常的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因（HPRT）。这个基因的产物催化次黄嘌呤合成次黄嘌呤单核苷酸（IMP），IMP可在细胞内转化c利用照射杂交法绘制遗传图谱成AMP和GMP。第20页/共74页照射杂交法操作程序含单一人染色体的杂合细胞用X射线照射，所有染色体均被打断成8Mb长的小片段，杂合细胞被杀死。然后将之与HPRT-的中国仓鼠细胞融合，融合细胞一般只含有两三个染色体碎片，不同的融合细胞含有不同的人染色体片段。最后再用一组人的DNA探针杂交融合细胞的染色体DNA片段。哪一对标记探针在同一融合细胞中同时呈杂交阳性的出现频率越大，它们彼此就靠得越近，反之亦然。这样，即可排出这这些标记的前后排列顺序。人的第18号染色体就是用此法制作了40Mb的遗传图谱。

X-射线照射细胞融合探针杂交人鼠杂合细胞HPRT缺陷型中国仓鼠细胞仓鼠融合细胞人染色体探针第21页/共74页6B

基因组图谱的制作

限制性片段长度多态性（RFLP，RestrictionFragmentLengthPolymorphism）技术特别适用于突变基因在染色体上的定位。其工作原理如下：基因突变会导致分子病尤其是遗传病的发生。这些突变包括核苷酸碱基点突变、缺失、插入，它们很可能在导致基因突变的同时，也使得限制性内切酶切位点发生变化，从而改变限制性内切酶酶解片段的长度。因而通过正常人与病人染色体酶切片段长度的对比d利用RFLP法绘制遗传图谱分析，便可找到突变基因，并将之定位于染色体的某一片段上。第22页/共74页RFLP的工作原理相同区条带：正常人与病人均存在的带谱，反映人种基因组的相似性离散区条带：正常人与病人均不相同的带谱，反映人个体基因组的差异性病变区条带：正常人与病人分别具有相同的特征带谱，但两者之间的相同区ABCDE

FGH

I离散区相同区病变区带谱显著不同，病变基因就位于这些条带上正常人病人DNA琼脂糖凝胶电泳图谱第23页/共74页杜兴肌营养不良症的病理杜兴肌营养不良（Duchenne

MuscularDystrophy）症是因为患者的DMD基因突变造成的，该基因编码Dystrophin蛋白。DMD病变基因的突变位点正好处于DNA上BglII的酶切位点内（AGATCT→AGGTCT），从而使得病人的该BglII位点消失，形成一个30kb的BglII片段，而正常人则为8kb和22kb两个BglII限制性片段第24页/共74页6B

基因组图谱的制作

高等真核生物的染色体DNA上存在着大量的重复序列，如长度在15-65bp范围内的小卫星DNA、长度在2-6bp范围内的微卫星DNA，后者又称为简短串联重复序列（SSR）。以SSR两侧的已知序列为引物，PCR扩增这一SSR序列，经测序便可鉴定该SSR的长度及重复单位数。通过对多个SSR序列的遗传连锁分析，即可测定这些SSR标记在染色体上的相对位置。1996年，利用上述原理绘制出的人类染色体完整连e利用PCR扩增法绘制遗传图谱锁图谱，相邻标记间的平均距离仅0.7厘摩。SSR1SSR2SSR3SSR4SSR5第25页/共74页6B

基因组图谱的制作PFGE：PulsedFieldGelElectrophoresis，即脉冲场凝胶电泳。遗传图谱是在染色体DNA上标注基因或遗传位点相对位置；而物理图谱则是标注限制性内切酶位点或已知DNA片f利用PFGE法绘制物理图谱NSWE段的实际位置。第26页/共74页特大型DNA片段的制备将细胞包埋在低温灌注的凝胶中；凝胶块用蛋白酶K、RNA酶（不含DNAase）处理，DNA在被固定后基本上不因剪切力而断裂；然后整个凝胶块用哺乳动物DNA上稀有的限制性内切酶消化，如NotI（GC/GGGCCGC）、SfiI（GGCCNNNN/NGGCC）等。经这两种酶分别酶切后，染色体DNA断裂成几百甚至几千kb的大片段。特大型DNA片段的分离采用PFGE技术可将200至3,000kb的DNA片段分开。消化后的凝胶块直接放入PFGE普通凝胶孔内，上千kb的DNA片段通常需要连续走几天电泳才能分开。第27页/共74页随机探针原位杂交人的第21号染色体的三种限制性酶切图谱就是采用这一技术制作的。

部分酶解

全酶解

1700kb

1400kb

1200kb

1000kb

700kb

200kb

S1探针杂交

S2探针杂交

S3探针杂交

1700140070012001000200第28页/共74页6B

基因组图谱的制作g利用DNA克隆片段的重叠性绘制物理图谱如果某一生物体的染色体DNA已被全部克隆，便可以借助于下列三种实验程序，确定每个克隆中的DNA片段的排列顺序，由此构成以酶切片段末端标记法克隆编号为标记的基因组物理图谱。随机探针联合杂交法染色体走读排序法C159C094····C436C512C298C777第29页/共74页酶切片段末端标记法HHHHSSSSSSSSSSSSSSSSSSS单一克隆指纹图谱十克隆指纹图谱载体DNA克隆DNA第30页/共74页将若干克隆固定在薄膜上，并复制20份薄膜；合成20种不同序列的短探针，其序列是随机的；用20种探针随机定位杂交（一对一）20份克隆薄膜；如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将阳性记为“1”，而阴性记为“0”，随机探针联合杂交法这样便可将结果清晰地列成一张表，最终排出上述克隆的排列顺序。第31页/共74页0102030405060708091011121314151617181920A

B

CD

E

FG0102030405060708091011121314151617181920DABCEFG111111111111111111111111111111第32页/共74页0104120613140214071911150508160310092018DABCEFG111111111111111111111111111111FCADGEB第33页/共74页染色体走读排序法

从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，阳性克分别亚克隆，亚克隆片段在0.5-2.0kb范围内。然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起。线型染色体DNA的端点。走读的起点克隆片段第34页/共74页染色体走读排序法走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列探针标记第一轮杂交阳性克隆阳性克隆第二轮杂交第二轮杂交第35页/共74页6C

基因组文库的构建原核生物的基因文库大都采用l-DNA或Cosmid载体构建，但若用Cosmid构建人的基因组文库，工作量太大，几乎难以进行。目前已发展了用酵母人造染色体（YAC）或细菌人造染色体（BAC）克隆几百甚至上千kbDNA大片段的技术，这样可大大简化构建人基因组文库的工作量。例如，要求人基因组文库的完备性为99.999%，若用Cosmid（装载量为40kb）构建一条人染色体的基因组文库（平均长度为150Mb），则需要4.3×104个克隆；而用YAC载体构建则仅需4.3×103个克隆，相当于将整条染色体DNA克隆10-15次。第36页/共74页6C

基因组文库的构建a用于大型基因组文库构建的克隆载体开发装载量在100-1000kb范围内的克隆载体是基因组计划实施的酵母人造染色体（YAC）重要条件。目前已发展了多种用于克隆大型DNA片段的特殊载体：细菌人造染色体（BAC）噬菌体人造染色体（PAC）可转化人工染色体（TAC）人类人工染色体（HAC）第37页/共74页6C

基因组文库的构建a用于大型基因组文库构建的克隆载体酵母人造染色体（YAC）细菌人造染色体（BAC）噬菌体人造染色体（PAC）可转化人工染色体（TAC）人类人工染色体（HAC）用于构建大型基因组文库的克隆载体的性能人造染色体类型载体名称复制子类型最大装载量pBeloBAC11大肠杆菌F性因子酵母自主复制序列2000kbpYAC4P1噬菌体DNA复制子300kb150kbpYLTAC17P1和Ri质粒复制子100kbpCYPAC1人染色体DNA复制子6000kb第38页/共74页YAC载体应含有下列元件：

酵母染色体的复制子

pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制起始位点

酵母染色体的中心粒序列

酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子

大肠杆菌的选择标记YAC载体的一般装载量为350-400kb，最高可达2000kb。酵母人造染色体载体pYAC4酵母染色体的端粒序列

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基因组文库的构建b单一染色体的分离纯化细胞培养物用有丝分裂抑制剂乙酰甲基秋水仙碱处理；有丝分裂停止了的细胞松散地贴在培养皿的底面上，稍稍抖动，即可将之收集到试管中；将细胞悬浮在染色体分离缓冲液中处理，以维持染色体结构，同时灭活细胞内核酸酶；染色体用DNA特异性染料染色，AT富含区由Höchst33258染色，GC富集区为色霉素A染色。染了色的染色体在合适波长下会发出荧光，Höchst染料的发光波长为351和363nm；色霉素A染料的发光波长为458nm。染了色的染色体由于DNA碱基排顺列序的差异而显示出不同的染料量比例和染色区域，从而构成每条染色体的特征性荧光谱。染色体的染色第40页/共74页荧光激活细胞分类仪当染色体溶液进入荧光激活细胞分类仪（FACS）后，在两种波长激光的照射下发出荧光，光电倍增管将光信号转换为电信号，并在染色体溶液中通电使染色体带电。然后通过电场收集单一染色体，并由电脑识别之。由于人的第9-12号染色体之间的差别不大，因此用FACS难以将之分开。收集细胞低渗裂解细胞进柱分离紫外激光发生器可见激光发生器第41页/共74页6C

基因组文库的构建c从单一染色体上分离纯化DNA片段利用超精细玻璃针在光学显微镜下将染了色的染色体各区带切开，并挑出染色体碎片；将染色体片段用蛋白酶消化，苯酚提取，乙醇沉淀，即可用于基因的定位克隆。从20条单一的人染色体上大约能获得0.3pg（0.3×10-12g）的DNA，这在克隆实验中已足够。第42页/共74页6C

基因组文库的构建dYAC基因组文库的构建程序单一染色体DNA用EcoRI部分酶解，PFGE电泳分离，切下350-400kb的条带，提纯DNA片段，或者密度梯度离心，除去300kb以下的DNA片段；pYAC载体用EcoRI/BamHI联合酶解，分离出长短臂；将DNA大片段与载体的两个臂相连；重组DNA分子电击转化酿酒酵母菌球形体；利用筛选标记筛选重组子，重组YAC具有与天然酵母染色体相似的性质，复制一次并进行有丝分裂。第43页/共74页YAC克隆DNA片段的程序按上述程序获得大片段的基因组文库之后，再利用DNA克隆片段的重叠性，以酶切片段末端标记法、随机探针联合杂交法、或染色体走读排序法绘制物理图谱。第44页/共74页6D

基因组序列的测定

DNA测序技术自Sanger于1977年发明的双脱氧末端终止法以来，先后经历了凝胶电泳测序、毛细管电泳测序、高通量平行测序三大技术革新。30多年前基于Sanger双脱氧末端终止法的手工测序能应付细菌基因组的分析，但已无法直接满足人类基因组测序的要求。一个训练有素的DNA测序员最快一天只能测定1kb的DNA片段，为了使误测率减小至最低程度，每个DNA片段两个方向至少共需测四次，即1kb的DNA片段一人需花四天时间才能完成！这还不包括模板克隆所花的时间，而后者花费的时间通常比测序更多。因此，必须发展新一代的DNA高速测序方法。目前实验室成熟或正在发展的DNA高速廉价测序方法包括：第45页/共74页a基于双脱氧末端终止法的全自动测序战略KlenowOH3'5'PTdNTP+

ddATP

TTTTTOH3'5'P传统的Sanger双脱氧末端终止法程序A

C

G

T

聚丙烯酰胺A

G

T

C

凝胶电泳DNA聚合测序反应克隆待测DNA片段OHHN阅读序列TACGACTCAGGATTGAC….第46页/共74页改进的全自动测序战略采用同样测序原理，但在进行四个DNA聚合反应时使用标记四种不同荧光基团的测序引物，这使得四个聚合反应物可混合在一起进行毛细管电泳分离，并可利用仪器自动识别阅读，从而大幅度提高测序的速度和精度。一台全自动测序仪每小改进的全自动测序战略时可测7kb，出错率仅为10-4。第47页/共74页6D

基因组序列的测定b基于DNA合成的单核苷酸加入测序战略

2005年底，美国454生命科学公司的JonathanRothberg及其同事推出了全新的基于DNA合成的超高通量测序系统，这套价格50万美元的系统连续阅读长度为330bp，可在8小时内完成450Mb的DNA测序工（1）待测DNA样品（模板）的预处理作！整个测序流程由下列四个环节组成：（2）待测DNA样品（模板）的PCR扩增（3）DNA测序反应（4）数据处理与分析第48页/共74页6D

基因组序列的测定b基于DNA合成的单核苷酸加入测序战略待测DNA样品（模板）的预处理A接头B接头高压气流随机打断400-600bp片段两端连接扩增和测序接头第49页/共74页6D

基因组序列的测定b基于DNA合成的单核苷酸加入测序战略待测DNA样品的固相乳胶PCR扩增（emPCR）变性结合包裹水油乳胶微泡释放随机打断微型磁珠第50页/共74页6D

基因组序列的测定b基于DNA合成的单核苷酸加入测序战略多重DNA测序反应3’T-C-G-A-G-G-G-A-C-C-A-G-T-C-G-T-A-5’A-G-C-T-C-C-GpppTPPi

+

APSsulfurylaseATPluciferaseluciferinoxy-luciferin+hv皮升板160万孔第51页/共74页6D

基因组序列的测定c基于DNA合成的循环可逆终止测序战略待测DNA样品的固相桥式PCR扩增双向引物均交联在载玻片上第52页/共74页6D

基因组序列的测定c基于DNA合成的循环可逆终止测序战略DNA的循环可逆终止的合成3’-阻断型的可逆终止核苷酸；四色荧光基团；核苷酸掺入后，洗去未反应的游离核苷酸，检测荧光信号，随后再利用特殊试剂分别除去信号基团和阻断基团，恢复3’-OH。第53页/共74页6D

基因组序列的测定c基于DNA合成的循环可逆终止测序战略DNA的循环可逆终止的合成3’-非阻断型的可逆终止核苷酸；四色荧光基团；抑制碱基掺入第54页/共74页6D

基因组序列的测定d基因芯片测序法

基因芯片是固定在玻璃、纸张、尼龙等固体平面上的寡聚核苷酸点阵（DNAArray，Genechip）。合成一定长度（12-24bp）的寡聚核苷酸全排列探针，分别固定在已知位置的芯片上。待测序DNA样品经处理（如超声波），形成一定长度的片段，标记荧光基团；然后与上述全排列芯片进行杂交；杂交后的芯片清洗条件控制在只允许与DNA样品100%配对的探针存在与芯片上；最后送入阅读仪检测，电脑识别杂交阳性荧光斑点，并根据芯片探针序列排列DNA的碱基顺序。第55页/共74页基因芯片测序原理ATCGAAGCATGTTCGAAGCATGTCTCGAGCATGTCATCAGCATGTCACGCAGCATGTCACGCGCATGTCACGGGCATGTCACGTGCATGTCACGTCGATGTCACGTCAGTGTCACGTCACGGTCACGTCACTGTCACGTCACTT•

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•TAGCTTCGTACAAAGGTGCCAGTGAAC荧光标记基团待测DNA样品探针基因芯片第56页/共74页基因芯片目前还无法用于测序，原因是点阵的集成度远远达不到要求。对于高等哺乳动物基因组的测序而言，芯片上的探针长度至少应在24个碱基，这样探针的全排列总数高达3X1014（424）！而目前基因芯片能达到的最大集成度芯片测序法的限制只有1X109。第57页/共74页6D

基因组序列的测定遵循信息科学界的“摩尔定理”十年间测序成本降低十万倍第58页/共74页6E

基因组结构的解析基因组DNA序列分析全部完成之后，人们即获得了基因组的序确定基因的位置，绘制基因图谱（结构基因组学）；列图谱。接下来的任务便是：确定基因转录的时空特异性，绘制转录图谱和表达图谱；确定基因的功能，绘制功能图谱（功能基因组学）。第59页/共74页6E

基因组结构的解析a在染色体DNA上定位基因人染色体DNA上的基因（尤其是蛋白质编码基因）排列得非常松散，以每个基因平均长度16kb、共2～2.5万个基因计算，基因区不足DNA总长的10%，且其中只有14%的DNA序列是基因编码区，而其它部分均为内含子结构。因而，即便获得了基因组DNA的序列，要想知道各基因的准确位置，也不是件容易的事。目前，已建立了多种有效测蛋白质编码基因的外显子边界的方法。第60页/共74页动物园杂交法（Zooblot）由于进化的原因，人体内绝大部分的蛋白质结构基因在其它哺乳类动物体内均存在，且具有高度的同源性。因而，在靶基因区域内任取若干DNA小片段为探针，杂交各种动物的DNA基因组。凡是在许多动物基因组上均有阳性反应的DNA探针片段，便极有可能是外显子，而内含子序列在动物种属之间通常是无同源性的。一旦一个基因的外显子全部找到，整个基因的左右边界便可确定。第61页/共74页GC岛探测法人类基因转录单位的上游，存在着GC丰富区，这一区域的DNA片段可用那些识别序列中富含GC的内切酶消化，能切开的地方很有可

能是基因的上游邻近区。例如：ApaI（GGGCCC）NarI（GGCGCC）XmaIII（CGGCCG）SmaI（CCCGGG）SstII（CCGCGG）BssHII（GCGCGC）第62页/共74页外显子扩增法将克隆的DNA片段插入到某一基因的两个外显子之间，并接在哺乳动物载体上，转化动物细胞。从中分离纯化mRNA，逆转录成单链DNA，PCR扩增，电泳比较cDNA片段大小。若克隆的DNA片段含有外显子，则cDNAE1E2Intron待测片段重组转录剪切反转录DNAhnRNAmRNAcDNA应比两个外显子更长。第63页/共74页cDNA杂交对比定位法以生物体特定组织或细胞的cDNA芯片杂交克隆的基因组DNA片段，杂交阳性的DNA克隆序列即为蛋白质编码基因。第64页/共74页6E

基因组结构的解析b确定基因的时空特异性表达谱生物体

肝脏