第十五章基因工程现代遗传学

第十五章基因工程现代遗传学第1页，共133页，2023年，2月20日，星期二第2页，共133页，2023年，2月20日，星期二

所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合。然后通过载体把重组ＤＮＡ分子引入受体细胞，使外源ＤＮＡ在受体细胞中进行复制和表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。所以基因工程（geneengineering）也称为遗传工程（geneticengineering）、基因操作（genemanipulation）、ＤＮＡ重组技术（recombinationDNAtechniques）。有时人们还称它为基因克隆（genecloning）或分子克隆（molecularcloning）。遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备，载体的选择，体外ＤＮＡ重组，重组ＤＮＡ引入受体细胞，克隆转化子的筛选，重组ＤＮＡ的检测等。第3页，共133页，2023年，2月20日，星期二第一节基因工程的酶学基础一、限制性核酸内切酸（restrictionendonuclease）：这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶（restrictionenzyme）。限制性内切酶本来是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：第4页，共133页，2023年，2月20日，星期二Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，所以在基因工程中应用不大。Ⅱ型酶：分子量较小（105Da），反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。Ⅲ型酶：这类酶可识别特定顺序，并在这一顺序的3’端24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。第5页，共133页，2023年，2月20日，星期二第6页，共133页，2023年，2月20日，星期二第7页，共133页，2023年，2月20日，星期二同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行切割，产生同样或不同的末端（视切割位点而定）。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。第8页，共133页，2023年，2月20日，星期二限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI:来自于Escheriacoli

RY13的第一个限制酶。第9页，共133页，2023年，2月20日，星期二二、末端转移酶（terminaltransferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反应与DNApolI相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。

第10页，共133页，2023年，2月20日，星期二第11页，共133页，2023年，2月20日，星期二

平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A第12页，共133页，2023年，2月20日，星期二三、ＤＮＡ连接酶（DNAligase）该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。

DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。第13页，共133页，2023年，2月20日，星期二第14页，共133页，2023年，2月20日，星期二四、反转录酶（reversetranscriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以ＲＮＡ为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。五、DNApolI及Klenow片段该酶常用于制备放射性比度比活体标记高得多的ＤＮＡ探针，探针的制备方法是采用所谓的缺口平移（nicktranslation）法制备的。该酶还用于裂口（gap）修补、反转录第二条链的合成（Klenow）、隐蔽末端的填平反应（Klenow）等。Klenow片段：DNApolI用枯草杆菌蛋白酶水解成两个片段，小片段（36KD）具有5’3’核酸外切酶活性，大片段（76KD）称为Klenow片段，具有DNA链聚合及3’5’核酸外切酶的活性。第15页，共133页，2023年，2月20日，星期二Klenow第16页，共133页，2023年，2月20日，星期二六、S1核酸酶：来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。七、碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记（脱P后利用T4多核苷酸激酶磷酸化）或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷反应。第17页，共133页，2023年，2月20日，星期二第二节目的基因的制备一、化学合成法：1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。在体外，可以合成一系列长约几百ｂｐ的寡聚核苷酸链，然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸链连接起来。化学合成的不足之处在于：（１）要已知基因的核苷酸顺序；（２）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（３）价格昂贵。第18页，共133页，2023年，2月20日，星期二

化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。同时，所合成的基因不含内含子。在原核生物中由于不能进行内含子剪接，所以一旦将含有内含子的基因引入原核生物中表达，其产物往往是没有活性的。由于化学合成法有上述一些优缺点，所以这种方法较多地用于合成一些比较小的基因，如某些激素基因。并也取得一些成功的例子，例如胰岛素基因，生长激素释放抑制激素基因等。由于技术的进步，目前已极少利用化学合成法制备目的基因，而是利用DNA的化学合成法合成一些短的DNA片段作为探针（probe）或PCR的引物。第19页，共133页，2023年，2月20日，星期二第20页，共133页，2023年，2月20日，星期二二、从cDNA文库或基因组文库中分离cDNA文库及基因组文库的构造我们将在后面讨论，如果制备好了cDNA文库或基因组文库，那么用原位杂交法来筛选（screening）所需要的目的基因所在的克隆子。将这一克隆子大量繁殖，提取ＤＮＡ，便可获得所需的目的基因。必要的时候还可以建立差示文库（differentiallibrary）。第21页，共133页，2023年，2月20日，星期二第22页，共133页，2023年，2月20日，星期二第23页，共133页，2023年，2月20日，星期二三、ＰＣＲ法：PCR（polymerasechainreaction)技术是Mullis于1986年发明的一项体外快速大量扩增ＤＮＡ片段的方法（获1994年诺贝尔奖）。其基本原理就是在体外模拟体内DNA复制的过程，在反应系统中加入欲被扩增的DNA片段，作为模板；人工合成的寡聚核苷酸，作为引物；耐热的DNA聚合酶（Taq）以及四种核苷酸三磷酸。反应时，先加热至约92℃，使模板变性。降温至约50℃使引物与模板结合（退火），加温至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮＡ链延伸。重复92℃（变性）、50℃（复性）、72℃（延伸）的过程使ＤＮＡ片段得到不断的扩增，可以重复几十个周期。ＤＮＡ片段将2n（ｎ为反应周期数）的倍数增加。第24页，共133页，2023年，2月20日，星期二第25页，共133页，2023年，2月20日，星期二第26页，共133页，2023年，2月20日，星期二四、mRNA差别显示分离目的基因

根据表达特征，真核细胞的基因可以分为两类：一是所谓的看家基因（house-keepinggene），另一类是受到严格调控的基因（developmentalregulatedgene）。在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对外界环境的压力的反应、在个体的衰老与死亡等不同的环境下发育调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differentialexpression）。mRNA的差别显示技术就是用来分离这些差别表达的基因的一项有用的技术。该技术是P.Liang&A.D.Pardee1992年建立的，全称为mRNA差别显示反转录PCR(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)第27页，共133页，2023年，2月20日，星期二原理：该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3’端引物：利用mRNA的polyA尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，polyA尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：第28页，共133页，2023年，2月20日，星期二根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由11~12个T及两个其它的碱基组成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。5’端引物：5’端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增，可获得50~100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5’随机引物。第29页，共133页，2023年，2月20日，星期二第30页，共133页，2023年，2月20日，星期二第三节基因工程载体载体（ｖｅｃｔｏｒ）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：第31页，共133页，2023年，2月20日，星期二分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。第32页，共133页，2023年，2月20日，星期二一、质粒（plasmid）载体质粒是一种独立于染色体外的小分子环状ＤＮＡ，一般大小约106~108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。第33页，共133页，2023年，2月20日，星期二以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）第34页，共133页，2023年，2月20日，星期二pUC系列：是目前最常用的E.coli质粒载体。包括pUC7、pUC8、pUC9、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等。优点：分子量更小，拷贝数更高：分子量在3Kb左右，拷贝数可达每细胞500~700个，因此不需要氯霉素扩增。引入多克隆位点（multiplecloningsites,MCS）方便操作。引入lacZ’基因方便筛选。第35页，共133页，2023年，2月20日，星期二第36页，共133页，2023年，2月20日，星期二第37页，共133页，2023年，2月20日，星期二筛选原理——α互补——兰白筛选：

LacZ’是lacZ基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。MCS也在这个区域内。这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称α互补。具有α互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培养基上会形成的兰色菌落。相反，不互补则产生白色的菌落。X-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。

IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。第38页，共133页，2023年，2月20日，星期二第39页，共133页，2023年，2月20日，星期二原核表达载体：pGEM系列包括pGEM-3、pGEM-3Z、pGEM-3Zf（-）、pGEM-4、pGEM-4Z等。带有噬菌体编码的RNA聚合酶启动子SP6及T7启动子，可用于外源基因的表达。第40页，共133页，2023年，2月20日，星期二第41页，共133页，2023年，2月20日，星期二pGEX系列：包括pGEX-1、pGEX-1λT、pGEX-2T、pGEX-3X等。该系列是一类融合表达载体，在克隆位点上游有一个谷胱甘肽巯基转移酶（glutathioneS-transferase，GST）基因的一个片段。融合位点上有特异蛋白酶水解位点，方便GST的去除。在GST上游有一个启动子Ptac（trp操纵子启动子与lac操纵子启动子的融合启动子），在IPTG诱导下表达。第42页，共133页，2023年，2月20日，星期二第43页，共133页，2023年，2月20日，星期二第44页，共133页，2023年，2月20日，星期二二、噬菌体（bacteriumphage,phage）载体：1、λ噬菌体载体：λ噬菌体的基因组结构：第45页，共133页，2023年，2月20日，星期二AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS

头部基因尾部基因功能不明区

溶原化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必须区段cI基因：溶原过程控制基因，第46页，共133页，2023年，2月20日，星期二第47页，共133页，2023年，2月20日，星期二插入式载体：λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。由于λ噬菌体包装时，只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，所以插入式载体可携带的外源ＤＮＡ片段较取代式为小。

第48页，共133页，2023年，2月20日，星期二cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16A第49页，共133页，2023年，2月20日，星期二取代式载体：野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的LacZ）替换λ噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。第50页，共133页，2023年，2月20日，星期二第51页，共133页，2023年，2月20日，星期二Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40第52页，共133页，2023年，2月20日，星期二（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）第53页，共133页，2023年，2月20日，星期二为避免载体自身连接产生的假阳性，可采用双酶解的方法。例如：λEMBL4EBSSBEEBSSBE

BSBSB欲克隆片B第54页，共133页，2023年，2月20日，星期二体外包装：

λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106~108/μgDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103~105/μgDNA。

λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5kb）的75%~105%。第55页，共133页，2023年，2月20日，星期二2、M13噬菌体载体：M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。第56页，共133页，2023年，2月20日，星期二M13噬菌体的特点：感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型ＤＮＡ（replicationformDNA,RFDNA）。可以象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RFDNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制约的，这一点正好与λ噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。第57页，共133页，2023年，2月20日，星期二第58页，共133页，2023年，2月20日，星期二RFDNA第59页，共133页，2023年，2月20日，星期二第60页，共133页，2023年，2月20日，星期二M13载体：具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13RFDNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离ＤＮＡ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源ＤＮＡ克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源ＤＮＡ分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。第61页，共133页，2023年，2月20日，星期二第62页，共133页，2023年，2月20日，星期二M13mp18MCSM13mp19MCSEcoRIBamHIHindIIIPstIBglIBglIPstIHindIIIBamHIEcoRIBPPBBPBPBPBamHI&PstI第63页，共133页，2023年，2月20日，星期二第64页，共133页，2023年，2月20日，星期二三、质粒与噬菌体的重组载体：1、cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。第65页，共133页，2023年，2月20日，星期二第66页，共133页，2023年，2月20日，星期二第67页，共133页，2023年，2月20日，星期二2、噬菌粒载体：

M13载体广泛应用于单链DNA的克隆，但它有明显的不足：插入外源DNA后，遗传稳定性下降；理论上说，M13载体没有包装限制，但它的有效克隆能力仅1500bp。这些限制了M13的应用，为解决这一问题，发展了噬菌粒载体。噬菌粒（phagemidorphasmid）是由单链噬菌体M13或f1与质粒载体重组而成的新型载体。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。第68页，共133页，2023年，2月20日，星期二第69页，共133页，2023年，2月20日，星期二第70页，共133页，2023年，2月20日，星期二四、YAC载体与YAC文库：

YAC（yeastartificialchromosome，酵母人工染色体）质粒载体是在人类基因组计划（HGP）实施的背景下发展起来的一类克隆特大片段的载体。这类载体含有酵母菌的复制起点ARS（automaticreplicationsequence,ARS），着丝粒CEN（centromere），端粒TEL（telomere），以及选择性标记和克隆位点；同时还含有大肠杆菌的复制起始点，可以在大肠杆菌中以环状质粒的形式存在。DNA体外重组后以原生质体转化的方式导入酵母细胞。这类载体克隆能力可达1~2Mb。主要用于基因组文库的构建。第71页，共133页，2023年，2月20日，星期二第72页，共133页，2023年，2月20日，星期二原核生物主要载体用途小结：

载体用途质粒

λcosmidM13YAC大片段DNA克隆—++—+基因文库构建—++—+cDNA文库构建++———序列分析+——+—单链探针———+—工程菌+————第73页，共133页，2023年，2月20日，星期二五、真核生物载体：由于真核生物与原核生物在ＤＮＡ复制和转录系统上存在着差异，所以要求用不同的基因载体。真核生物基因工程载体的要求与原核生物基因工程载体大体相似，所不同的是：它除了含有真核基因的转录和复制的必要结构外，还必须含有细菌的转录和复制的必要结构，以便能在细菌中大量繁殖。含有细菌及哺乳动物细胞中的双重选择性标记，这就是所谓的穿梭质粒，可在哺乳动物和原核生物之间穿梭。第74页，共133页，2023年，2月20日，星期二植物基因工程载体：用于植物基因工程的载体有Ti质粒载体及病毒载体两类。

Ti质粒是存在于根癌农杆菌的一种质粒。根癌农杆菌感染植物时，会在植株的根——茎结合部产生未分化的细胞团，即冠瘿瘤。有意思的是在形成冠瘿瘤的同时，一部分Ti质粒（TDNA）可以重组到植物染色体中去，这一特性使Ti质粒有希望成为有效的植物基因工程载体，事实上，Ti质粒是迄今研究得最多的植物基因工程载体。第75页，共133页，2023年，2月20日，星期二第76页，共133页，2023年，2月20日，星期二由于Ti质粒的宿主范围较窄，仅感染某些双子叶植物，因此人们又发展了另一类植物基因工程载体—病毒载体。常用的植物病毒载体有以下几类：ssRNA病毒：例如烟草脆裂病毒（TRV），必须先将单链RNA反转录成双链的cDNA，才可作为载体。ssDNA病毒：例如双子座病毒，这类病毒可感染单子叶植物，所以是很有前途的一类载体。dsDNA病毒：这是研究得最多的植物病毒载体，例如花椰菜花叶病毒。第77页，共133页，2023年，2月20日，星期二哺乳动物基因工程载体：目前使用的哺乳动物基因载体大多由哺乳动物病毒经改造而成。用得比较多的病毒有猴空泡病毒（SV40）、单纯疱疹病毒（HSV）、Rous肉瘤病毒、EB病毒等。在哺乳动物细胞内表达的载体必须考虑以下几个表达元件：启动子与增强子终止信号与加尾信号剪接识别信号复制与选择元件第78页，共133页，2023年，2月20日，星期二选择系统：HAT选择系统——胸苷激酶(TK)、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）、二氢叶酸还原酶（DHFR）系统：嘌呤合成：谷氨酰胺+PRPPIMPAMPGMPFH4FH2

H

XGPRT天冬氨酸UMPCMPTMP

FH4FH2TTK第79页，共133页，2023年，2月20日，星期二7,8二氢叶酸+NADPH+H+5,6,7,8四氢叶酸+NADP+

DHFR氨甲喋呤抑制选择原理：

tk基因及xgprt基因的筛选：受体细胞必须是相应的tk-或xgprt-，将细胞培养在含HAT（H：黄嘌呤，A：氨甲喋呤，T：胸苷）的培养基中。在A存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。这三种核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk或xgprt基因的存在细胞才可生长。dhfr基因的筛选：受体细胞必须是dhfr-

，当受体细胞培养在不含HT的培养基中，受体细胞不能生长。第80页，共133页，2023年，2月20日，星期二新霉素抗性选择系统：新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制作用，但新霉素的类似物G418对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核细胞中表达并能使G418失活（neo基因编码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。氯霉素乙酰转移霉检测系统：氯霉素乙酰转移酶（CAT）可使氯霉素乙酰化而失去活性。当cat基因在真核细胞内表达后，制备细胞提取物，然后加入乙酰辅酶A及14C标记的氯霉素，如果细胞中存在cat，可使氯霉素乙酰化，通过薄层层析将乙酰化及未乙酰化的氯霉素分开，再用放射自显影检测。第81页，共133页，2023年，2月20日，星期二带有单纯疱疹病毒HSV的片段，tk基因，tk启动子和加尾信号第82页，共133页，2023年，2月20日，星期二带有小鼠乳腺病毒MMTV的LTR启动子（PLTR），gpt（xgprt），加尾信号等第83页，共133页，2023年，2月20日，星期二带有SV40早期启动子（PE），加尾信号。原核生物的启动子T7及Ptac等。第84页，共133页，2023年，2月20日，星期二第四节重组DNA导入受体细胞一、原核生物的转化（transfomation）与转染（transfection）E.coli的钙转化：细菌细胞在一定的生理状态（感受态），或经CaCl2处理，或制备成原生质体的情况下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用这一特性可将重组ＤＮＡ导入受体细胞中，用质粒作载体的遗传工程一般使用这种方法。由于E.coli不会自发地产生感受态，因此E.coli的转化一般采用钙转化法。该方法是将E.coli用冷CaCl2(0℃)致敏，而后在高温（42℃）下热休克，这样可使外原DNA进入受体细胞。第85页，共133页，2023年，2月20日，星期二E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外原DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高2~3个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。原核生物的转染：转染是指转化感染（Transfection来自于transfomation与infection），所以凡是以噬菌体（如M13）或病毒为载体，以转化的方法将DNA导入细胞的方法均称为转染。因此转染就方法来说与转化是一样的。第86页，共133页，2023年，2月20日，星期二二、体外包装与转导（transduction）：

以λ噬菌体作为载体，常利用转导的方法将重组DNA导入受体细胞。噬菌体载体在体外与目的DNA片段重组后，与噬菌体的头部蛋白及尾部蛋白混合保温，让DNA在体外进行包装，产生有感染能力的噬菌体颗粒。利用这种噬菌体感染受体细胞从而将重组DNA导入受体细胞内。包装蛋白的制备可采用单菌株法或双菌株法。单菌株法是利用cos突变的溶源菌。双菌株法则利用两株不同的突变菌株，如BHB2688是编码头部蛋白的E基因突变，BHB2690是编码头部蛋白的D基因突变，两个菌株经诱导后都能合成包装蛋白，但不能进行包装，当两者的蛋白质混合后便具有包装能力。第87页，共133页，2023年，2月20日，星期二第88页，共133页，2023年，2月20日，星期二三、真核生物的转染：磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样，主要用于植物细胞的转染。第89页，共133页，2023年，2月20日，星期二基因抢转染法：主要用于植物细胞的转染。利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。激光微束穿孔法：主要用于叶绿体或线粒体的基因工程操作。利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA进入细胞。显微注射法：主要用于动物细胞或植物的原生质体，利用毛细管直接将DNA注入细胞内。第90页，共133页，2023年，2月20日，星期二脂质体（liposome）介导法：主要用于动物细胞或植物的原生质体。将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。多聚物介导法：用于动物细胞或植物的原生质体。利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。第91页，共133页，2023年，2月20日，星期二第五节克隆子的筛选与鉴定一、克隆子的筛选：利用载体的选择性标记进行筛选。二、克隆子的鉴定：遗传检测法：该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受体细胞，当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表型时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因。优点：简便、快速，结果较可靠。缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。第92页，共133页，2023年，2月20日，星期二凝胶电泳检测法：该方法利用凝胶电泳的方法检测重组DNA分子或克隆片段的大小（分子量）。优点：简便、快速。缺点：只能提供克隆片段大小的信息。免疫化学检测法：利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。放射性标记抗体检测法：该方法类似于原位杂交法。优点：方法简便，一次可检测大量的克隆子。缺点：克隆基因必须表达并具有相应的抗体。第93页，共133页，2023年，2月20日，星期二放射性标记抗体检测法的原理第94页，共133页，2023年，2月20日，星期二滤膜培养皿及菌落抗体溶液放射性标记抗体检测法的操作程序第95页，共133页，2023年，2月20日，星期二ELISA检测技术：ELISA（enzymelinkedimmuno-sorbentassay）是一种固相免疫检测技术。比较常用的方法有用于检测抗原的双抗体夹心法和用于检测抗体的间接法两种。因此，基因工程中用于检测克隆基因表达产物的方法主要是双抗体夹心法。优点：能进行定量检测，因此该方法更多地用于基因表达产物的定量分析。缺点：较繁琐。基因必须表达。第96页，共133页，2023年，2月20日，星期二第97页，共133页，2023年，2月20日，星期二分子杂交技术检测法：包括菌落或噬菌斑的原位杂交技术。优点：方法简便、快速。缺点：必须具有相应的探针。杂交抑制翻译法：该方法用于cDNA文库中目的基因的筛选。其原理是利用cDNA与mRNA杂交后导致mRNA的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。优点：不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。缺点：较烦琐。DNA序列分析：该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。第98页，共133页，2023年，2月20日，星期二各克隆子提取相应的cDNA从cDNA文库相应的细胞提取mRNA

混合杂交无细胞翻译体系（麦胚或网织红细胞提取物）体外翻译35S标记甲硫氨酸

聚丙烯酰胺凝胶电泳

放射自显影分析比较，找出目的蛋白不合成的克隆子即为目的基因第99页，共133页，2023年，2月20日，星期二PCR第100页，共133页，2023年，2月20日，星期二第六节文库的构建一、cDNA文库（library）的构建

cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。为了得到特定基因的cDNA片段，就需要先分离出有功能的特定mRNA。所以首先必须考虑从什么细胞，用什么方法将ｍＲＮＡ提取出来。这是由于不同细胞可限定合成不同的蛋白质，这样在一些组织细胞中除了含有普通蛋白质的mRNA外，还会有数量较多的特定mRNA。第101页，共133页，2023年，2月20日，星期二mRNA的分离有许多种方法，例如化学的方法，物理的方法（如差速梯度离心法）等。有的还可以利用真核生物的mRNA具有的polyA尾巴进行亲和层析法分离mRNA。有的则采用几种方法联合使用，其总的目标就是获得纯度高、得率高的有活性的mRNA。在取得mRNA后，接下来就是将mRNA通过反转录酶合成杂种DNA链（DNA-RNA分子），在碱（KOH）作用下水解RNA链，然后经DNA聚合酶I作用再合成第二条DNA链，即形成双链cDNA分子，将双链cDNA插入载体后形成重组体，并导入细菌中，随细菌的繁殖而扩增和克隆，形成cDNA文库。第102页，共133页，2023年，2月20日，星期二第103页，共133页，2023年，2月20日，星期二第104页，共133页，2023年，2月20日，星期二二、基因组文库的构建基因文库（genelibrary）：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于线粒体或叶绿体ＤＮＡ的基因文库。由于制备ＤＮＡ片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的ＤＮＡ片段即可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近ＤＮＡ顺序。第105页，共133页，2023年，2月20日，星期二

基因文库的构建就是利用所谓的“鸟抢法”，使基因组的DNA片段随机地插入适当的载体中，导入细胞进行大量繁殖而构建的。用于构建基因文库的片段的产生大致有两种方法，一是用限制性内切酶完全消化基因组DNA，这个方法有两个特点。第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。第二，一般常用的限制酶大多识别六个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小（约4kb即46＝4096bp），因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。第106页，共133页，2023年，2月20日，星期二

用于制备基因组文库的随机片段的另一种方法是采用机械随机切割。这种方法可以制备大片段的DNA（用噬菌体λ作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb），从而克服上述的两个缺点。但是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体ＤＮＡ进行连接。用于基因文库构建的载体常用噬菌体λ或cosmid载体，因为它们的容量比较大，可克隆大片段的DNA。虽然cosmid载体比λ载体的容量大，但由于文库的保存（cosmid载体在E.coli中，λ载体在噬菌体中）λ比cosmid容易，因此λ载体用的更多些。第107页，共133页，2023年，2月20日，星期二第108页，共133页，2023年，2月20日，星期二基因组文库的克隆数：由于基因文库的DNA片段是随机克隆的，因此要保证任何一个基因在文库内都能找到，基因组文库的克隆数量必须达到一定的数量。1975年Clarke&Carbon提出一个计算公式：

ln(1-P)N=ln(1-L/M)P：任一基因在文库中出现的概率L：克隆片段的平均大小M：基因组的大小例：人的基因组大小为3x109bp，克隆片段的平均大小为19kb，P=0.99。N=7.3x105，即该文库的克隆子数必须达到73万。第109页，共133页，2023年，2月20日，星期二三、差异文库（differentiallibrary）的构建差异文库又称差示文库、扣除文库（subtractedlibrary）。用于克隆不同组织细胞或同一组织细胞处于不同功能状态下基因表达差异的cDNA文库。这种方法特别适用于克隆在特定细胞中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、在特定发育阶段表达或参与发育调节的基因