细胞产物分析技术细胞产物分离方法

细胞产物分析技术细胞产物分离方法第1页，共88页，2023年，2月20日，星期二样品的预处理细胞产物的提取细胞产物的分离产物的分析鉴定经典分离方法红外光谱紫外可见光谱色谱分离法质谱核磁共振谱第2页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液-液萃取法利用组分在两个互不相溶的液相中的溶解度差异而将其从一个液相转移到另一个液相的分离过程称为液液萃取，也叫溶剂萃取，简称萃取。待分离的一相称为被萃相，萃取后成为萃余相，用做分离剂的相称为萃取相。第3页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液-液萃取法

被萃取组分在萃取相中的溶解度要大于被萃取相。一般一相为水相，一相为有机相。在水相中增加盐离子浓度可以降低有机相在水中的溶解度。萃取应采用少量多次原则。从水相中萃取有机物质时，单级萃取时一般选择该物质的最佳溶剂。多级萃取溶剂选择一般从弱极性→强极性。密度：石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丁醇、苯<水<二氯甲烷、氯仿第4页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液-液萃取法用一种强极性溶剂直接提取后再用极性不同的溶剂与强极性溶剂的提取液进行液／液两相梯度萃取第5页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法根据液滴状态的不同可分为单滴液相微萃取(SD-LPME)和中空纤维液相微萃取(HF-LPME)；根据悬挂液滴位置的不同可以分为直接液相微萃取(D-LPME)和顶空液相微萃取(HS-LPME)；根据操作方式的不同可以分为静态液相微萃取(S-LPME)、动态液相微萃取(D-LPME)和连续流动液相微萃取(CFME)；根据作用相的多少可分为两相液相微萃取和三相液相微萃取(LLLME)第6页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法单滴液相微萃取(SD-LPME)是将萃取用的有机溶剂液滴悬挂在微量进样器的针端。同液-液萃取一样，单滴液相微萃取也是基于分析物在不同相中分配系数不同而达到萃取的目的。有机相液滴体积一般为1-5微升，远远小于样品体积，所以可以达到对待测物的富集。第7页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法直接液相微萃取：萃取溶剂液滴直接浸渍于样品中，对分离富集洁净样品中的低浓度分析物效果较好，但对含固体颗粒或含有能乳化有机溶剂的复杂基质样品的萃取效果较差。顶空液相微萃取：萃取溶剂液滴与样品基质不直接接触，适用于复杂基质中微量挥发性或半挥发性成分的萃取。第8页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法第9页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法静态模式萃取：将有机溶剂液滴悬挂于微量进样器的针头上，萃取一定时间后将溶剂抽回针头中，直接进样分析。操作简单，但易受溶剂的溶解或挥发损失以及脱落的影响，且富集效果相对较差。动态模式萃取：用微量进样器抽取一定量溶剂，置于萃取位置后抽取空气或水样进入针头，停留一定时间，萃取被吸入微进样器的试样中的目标分析物，而后推出空气或水样但不推出溶剂，如此反复数次，最后将有机溶剂相直接进样分析。动态萃取通过变溶剂微滴为溶剂薄膜，大大增加了萃取的表面积，使萃取效率更高。第10页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法连续流动液相微萃取法（CFME）是在直接液相微萃取方法上改进而来。先用泵将被萃取的水溶液充满PEEK管以及萃取单元的玻璃容器中，再将所需体积的有机溶剂用微量注射器从玻璃容器的注射口注射到样品水溶液中，并在针尖形成液滴悬挂，在蠕动泵的作用下，不停流动的水溶液不断与有机液滴接触，分析物不断被富集到微滴中，萃取完成后将有机液滴吸回，直接进样分析。第11页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法液相微萃取法第12页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法中空纤维液相微萃取(HF-LPME)以多孔的中空纤维为微萃取溶剂(接收相)的载体，将有机萃取溶剂固定到中空纤维壁内的微孔里，通过有机溶剂在纤维壁孔中形成的液膜进行传质，在多孔的中空纤维腔中进行微萃取。根据接受相与微孔中溶剂的异同，HF-LPME分为两相和三相液相微萃取。优点：避免了单滴液相微萃取溶剂容易损失、移位、无法提高搅拌速度等缺点；具有突出的样品净化功能，扩大了分析底物范围，可用于复杂基质样品的直接分析；具有较高的富集倍数和灵敏度。第13页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法第14页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法举例

测定乳制品中的三聚氰胺：将中空纤维切成2.3～2.5cm小段，放入有机溶剂磷酸三丁酯(TBP)

中超声10s，使中空纤维壁孔充满TBP，再将其套在微量进样器(已经吸入25μL接受相)针尖上，接受相推入中空纤维，两端用热钳子封住，使中空纤维保持约2cm长度。放入给出相内，在恒温磁搅拌仪上以一定速率搅拌，萃取一定时间后取出，剪开封口，用进样针抽回接收相，用5μL进行高效液相色谱测定。第15页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法与液液萃取法比较适应了绿色分析技术发展的需要（液液萃取消耗mL级有机溶剂，液相微萃取仅需μL级）富集倍数大，萃取效率高（富集倍数达1000倍），可使分析方法的灵敏度提高两个数量级以上便于与具有微量进样方法的特定仪器联用。样品溶液用量少(l~10mL左右)第16页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——液相微萃取法影响因素萃取溶剂的影响萃取温度的影响盐效应和pH值的影响搅拌速度的影响应用环境分析：水样、土壤、大气药物分析：血样、尿样、唾液、乳汁食品分析：饮用水、酒、饮料、蔬菜第17页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——蒸馏和分馏法利用提取成分具有不同沸点的性质，可使用蒸馏和分馏法对植物成分进行分离。在分离毒芹总碱中的毒芹碱和羟基毒芹碱时，以及分离石榴皮中的伪石榴皮碱、异石榴皮碱和甲基异石榴皮碱时，均可利用常压或减压分馏方法进行初步分离，然后再精制纯化。第18页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——分子蒸馏技术一种特殊的蒸馏分离技术在通常的蒸馏（精馏）过程中，存在着两股分子流向：一股是被蒸液体的气化，由液相流向气相的蒸气分子流；另一股是蒸气返回至液相的分子流。当气液两相达到平衡时，表观上蒸气分子不再从液面逸出。假若采用某种措施，使蒸气分子不再返回（或减少返回）液相，就会大大提高分离效率。第19页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——分子蒸馏技术Bronsted和Hevesy在1922年设计了世界上第一套真正的实验用分子蒸馏装置，利用该装置进行水银同位素分离的研究Burch等人制造了另一种盘式的分子蒸馏实验装置，蒸馏出了一些高分子量的油脂第一个具有工业应用价值的分子蒸馏器是降膜式的，它依靠重力作用使被蒸馏物料在蒸发器上形成一层薄膜。第20页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——分子蒸馏技术技术原理分子碰撞分子的平均自由程液体混合物受热后分子运动会加剧，当某些分子吸收到足够的能量时，就会从液面逸出成为气相分子随着逸出分子的增多，有一部分气相分子又会返回液相，在外界条件保持恒定的情况下，最终达到分子运动的动态平衡。第21页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——分子蒸馏技术降膜蒸馏装置第22页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——分子蒸馏技术1935年Hickman领导的小组设计出了世界上第一台离心式分子蒸馏器第23页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——分子蒸馏技术1940，离心式分子蒸馏器结构复杂成本昂贵，工业上出现了结构简单、成本低廉的刮膜式分子蒸馏器从上世纪60年代至今持续发展第24页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——分子蒸馏技术我国上世纪60年代才有涉及。1986年蔡沂春申请了关于M型分子蒸馏器的专利；至上世纪80年代末期，国内引进了几套分子蒸馏生产线，用于硬脂酸单甘油酯的生产。北京化工大学从1990s对分子蒸馏技术进行研究，从小试、中试至工业规模化生产，建立分子蒸馏生产装置30余条。第25页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——分子蒸馏技术普通蒸馏在沸点温度下进行分离，分子蒸馏可以在任何温度下进行，只要冷热两面间存在着温度差，就能达到分离目的。普通蒸馏是蒸发与冷凝的可逆过程，液相和气相间可以形成相平衡状态；而分子蒸馏过程中，从蒸发表面逸出的分子直接飞射到冷凝面上，中间不与其它分子发生碰撞，理论上没有返回蒸发面的可能性，所以，分子蒸馏过程是不可逆的。普通蒸馏有鼓泡、沸腾现象；分子蒸馏过程是液层表面上的自由蒸发，没有鼓泡现象。第26页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——分子蒸馏技术技术特点§操作温度低§蒸馏压强低§被分离物质受热时间短§产品品质和产品收率高第27页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——沉淀法沉淀分离是将被测组分和干扰组分通过一个沉淀反应而使其中一个置于液相，另一个置于固相，最后通过相分离的方法将二者分离。沉淀分离中加入的沉淀剂可以是和被测组分作用使其转至固相，也可以是和干扰组分作用使干扰组分转至固相，具体使用哪种方法要根据分析对象、干扰物质、实验条件来具体决定。按照沉淀分离中使用的沉淀剂类型和沉淀时采用的方法不同可将它分成三个大类：无机沉淀剂分离法、有机沉淀剂分离法和共沉淀分离法。第28页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——沉淀法第29页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——膜分离法利用小分子物质在溶液中可通过具有一定孔径的膜，而大分子物质不能通过的性质达到分离的目的。常用于蛋白质、多肽、多糖等大分子化合物与无机盐、单糖、双糖等小分子化合物的分离。根据所用膜的孔径大小不同可将膜分离法分为超滤及纳滤。因不使用大量有机溶剂具有很大优越性。大豆蛋白的工业化生产中即采用膜分离法。第30页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——升华法固体物质受热时，直接变成气态此现象称为升华。植物中凡具有升华性质的化合物均可用此法进行纯化。樟木中的樟脑、茶叶中的咖啡碱及存在于植物中的苯甲酸等成分。升华法简单易行，但往往产率低，还可能伴有分解现象。第31页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——升华法第32页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——结晶法植物中某一成分含量特别高时，找到合适的溶剂进行提取．提取液放冷或稍浓缩，便可得到结晶。不需复杂的仪器设备，相对于制备色谱分离方法，成本低适于大量制备。效率低，无法适用于一些微量成分或难以结晶成分的分离。需利用X射线衍射方法确定化合物分子结构时，获得好的单晶仍是重要的。第33页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——结晶法通过反复结晶得到纯粹的单一晶体的过程称为复结晶或重结晶。需要结晶的溶液呈过饱和状态，在加温的情况下，使化合物溶解过滤除去不溶解杂质，浓缩，放冷，析出。有时溶液太浓，黏度大就不易结晶；或析出结晶的速度快，颗粒较小，夹杂的杂质可能多。第34页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——结晶法浓度适中，逐渐降温，有可能析出纯度较高的结晶。X射线衍射用的单晶即采用此法制备。选用溶剂最好能对所需成分的溶解度随温度的不同而有显著的差别，即热时溶解冷却则析出。对杂质来说，在该溶剂中应不溶或难溶；也可采用对杂质溶解度大的溶剂而对欲分离物质不溶或难溶，则可用洗涤法除去杂质后再用合适的溶剂结晶。重结晶用的溶剂可与结晶溶剂相同。也可不同达到利用不同溶剂结晶除去不同杂质的目的。第35页，共88页，2023年，2月20日，星期二经典分离方法——结晶法每种化合物的结晶都有一定的形状、色泽和熔点。纯结晶性化合物都有一定的晶形和均匀的色泽，通常在同一种溶剂下结晶形状是一致的。纯化合物结晶的熔点熔距应在0.5℃左右，但由于晶体结构的原因可允许在1～2℃内。重结晶溶剂不同，有时呈双晶现象，熔点可以有很大的差别。如血根碱(sangmnanne)在乙醚、氯仿和乙醇三种溶剂中所析出的结晶熔点不一样，分别为266℃、242~243℃和195~197℃。第36页，共88页，2023年，2月20日，星期二第37页，共88页，2023年，2月20日，星期二1906年俄国植物学家MikhailTsvet将含有植物叶子色素的溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率通过柱子，并彼此分开，由此得名为色谱法（Chromatography），又称层析法。色谱分离方法第38页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离方法20世纪60年代末出现了高效液相色谱，它在分离速度及分辨率上比起经典的液相柱色谱具有更大优越性。高效液相色谱仪可配以紫外等不同类型的检测器，用于各种化合物的分析、制备。近年来，高效液相色谱仪与质谱、核磁共振谱仪的联机使用，更加提高了高效液相色谱仪的应用范围和效能。第39页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法色谱法是又叫层析法，是利用不同的物质在固定相与流动相中不同的平衡分配系数来进行分离的一种方法。所有的色谱系统都由两相组成：固定相：是固定不动的一相，是固体物质或者是固定于固体物质上的成分。流动相：是流动的一相，可以是气体或液体，如水和各种有机溶剂。第40页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，随着流动相移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢，从而实现分离。第41页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法气相色谱液相色谱按流动相划分气-液色谱气-固色谱液-液色谱液-固色谱按固定相划分吸附色谱分配色谱排阻色谱离子交换色谱按色谱过程机理划分反相色谱正相色谱按固定相与流动相的相对极性大小划分第42页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法吸附色谱：吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异来达到分离的目的。分配色谱：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同而分离。排阻色谱：利用分子大小不同而阻滞作用不同进行分离的过程。离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离。第43页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法柱色谱：固定相装填在圆柱状上、下开口的玻璃、不锈钢柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离。薄层色谱：将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离。纸色谱：用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离。第44页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱最常用的色谱分离手段，目前仍是进行植物次生代谢产物分离的主要手段。一般使用圆柱状玻璃或不锈钢材料，内径1-10厘米，通常2-5厘米，柱高为内径的10~20倍。固定相填充在柱内，样品加在固定相的顶端，流动相从顶端加入，靠重力作用驱动流动相流经固定相。常用固定相:常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等步骤包括：装柱、上样、洗脱、收集第45页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱第46页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱常用固定相——硅胶

柱层析硅胶是具有固体特性的胶态体系，由形成凝集结构的胶体粒子构成。胶体粒子是水合状态硅胶（多硅酸）的缩聚物，属非晶态物质。它具有多孔性的硅氧环（siloxane）及Si－O－Si－的交链结构其骨架表面的硅醇（silano）基团能通过氢键与极性或不饱和分子相互作用。胶体粒子的集合体的间隙形成内部的微孔隙结构。因此，它是一种具有丰富微孔结构，高比表面积、高纯度、高活性的优质吸附材料。可用通式SiO2·xH2O表示。

第47页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱常用固定相——硅胶

价格低廉，可供选择的溶剂种类多，样品损耗少，分离后溶剂易于除去，分离速度快，因而是液-固色谱的最主要载体。

适用范围广，能用于非极性化合物也能用于极性化合物，如芳香油、萜类、甾体、生物碱、苷类、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸及一系列合成产物等的分离。

第48页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱常用固定相——硅胶

柱层析硅胶（细孔）粒度目数平均孔径比表面积孔体积（约）180-250μm60-8020-30Aо

>600m2/g0.4ml/g150-180μm80-10020-30Aо

>600m2/g0.4ml/g125-180μm80-12020-30Aо

>600m2/g0.4ml/g75-150μm100-20020-30Aо

>600m2/g0.4ml/g45-75μm200-30020-30Aо

>600m2/g0.4ml/g柱层析硅胶（粗孔）粒度目数平均孔径比表面积孔体积（约）180-250μm60-10080-100Aо

300-400m2/g0.8ml/g125-180μm80-12080-100Aо

300-400m2/g0.8ml/g75-150μm100-20080-100Aо

300-400m2/g0.8ml/g45-75μm200-30080-100Aо

300-400m2/g0.8ml/g第49页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱常用固定相——硅胶

硅胶的吸附性能取决于硅

胶中硅醇基的数及含水量。

随着水分的增加吸附能力

降低。若吸水量超过12％，

吸附力极弱，不能用做吸附色谱，只可用于分配色谱的载体。

硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均直接影响着色谱分离的效果。第50页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱常用固定相——硅胶

硅胶应是中性无色颗粒，由于制备过程中接触强酸常带有酸性，故在使用前应检查其水浸液的酸度不低于pH5

时才可使用；否则应用水洗至中性再在110℃活化24小时。

硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶解性，约为0.01％。在pH=9以上，则溶解度急剧上升。

有时可以向硅胶中掺入某种试剂以改良吸附性能，提高分离效果。通常用硝酸银处理过的硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用。改良吸附剂的制备一般是将含1％~10％填加试剂的水或丙酮溶液与硅胶混匀，稍后于110℃干燥即可。第51页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱常用固定相——硅胶

硅胶的再生一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂烘干活化处理即可使用。必要时用0.5％氢氧化钠水溶液浸泡洗涤、过滤、水洗，再以5％～10％盐酸浸泡洗涤最后用蒸馏水洗至中性，110℃活化，过筛即可。

50~200μm的硅胶每克吸附剂承载10mg样品，吸附剂每克硅胶载样30mg时只能用于被分离物质的Rf值差别很大的情况。上样较多时可达到过滤的目的。

第52页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱常用固定相——氧化铝色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4-4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9-10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。第53页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱常用固定相——氧化铝

常用规格：50～100目、100～200目、200～300目、300～400目、400～500目、500目以上

外观白色微球和沙状白色微球白色微球

粒径(μm)≥75(%)≤250≤250≤250

PH值4.5～5.56.5～7.5≥8

酸碱度酸性中性碱性第54页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱常用固定相——聚酰胺

由酰胺聚合而成的一类高分子物质，又

称锦纶、尼龙等，层析常用的是锦纶－6

和锦纶－66；其单体物质是已内酰胺、已二胺和已二酸。分子中的酰胺键是其结构的重要部分，酰胺键也是与其它极性键基团产生氢键的物质基础。是吸附层析，酰胺键与物质分子中的极性键的相互作用应该是吸附作用的主要原因；分离物质的氢键作用是聚酰胺层析的根本原因；但非氢键物质也可用聚酰胺进行分离。原理目前尚未完全阐明。第55页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱常用固定相——聚酰胺

通常有两种杂质：一种是蜡质，另一种是锦纶的聚合原料单体及其小分子聚合物。原料单体及其小分子聚合物可与酚类物质形成复合物，而蜡质能被醇液洗脱下来，与分离之物质混在一起则难以除去。除去原料单体及其小分子聚合物的方法是用二甲基甲酰胺（DMF）或DMF：醋酸：水：乙醇（5：10：30：20）混合液洗脱。除去蜡质的方法是用甲醇：二氯乙烷（1：1）混合液洗脱。第56页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱装柱要求:固定相的上表面一定要平整，并且固定相的高度要根据需要，短了可能分离效果不好，长了也会出现扩散或拖尾导致分离效果不好。湿法装柱:是先把硅胶混悬于流动相溶剂中，然后加入到装有溶剂的柱子顶端，在保持一定流速的条件下固定相逐渐沉积并达到需要的高度，并始终保持一定的液面高度，不可将柱子“走干”，最大的优点是柱子装的比较结实，没有气泡。第57页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱装柱干法装柱：直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，减压抽气可以使得柱子装得结实，接着是用洗脱剂“走柱子”，干法装柱较方便，技术要求低，但容易产生气泡，在上样前需要用大量溶剂淋洗才能达到湿法装柱的效果。因而相对成本较高。第58页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱上样湿法上样：适合湿法的样品是粘度不大均匀液体样品或者在极性弱于洗脱剂的溶剂中溶解度好的固体样品，需保证上样过程中不会析出。用于溶解样品的溶剂体积应越少越好。样品沿柱子内壁于硅胶面上方0.5cm以内距离均匀地加样，加样的速度以柱子不出现气泡为限。待所有样品上完后，用尽可能少的溶剂洗涤样品瓶，待样品在固定相上恰好走干后依上样法将溶液加到固定相上。第59页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱上样干法上样：干法就是把待分离的样品用少量低沸点溶剂溶解后，再加入少量固定相，拌匀后再挥干溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层，注意保留足够的溶剂使加入的干粉恰好能被覆盖以防柱子开裂。此时加入的干粉层中可能会有大量的气泡，但由于是松的，可以用玻棒稍做搅拌以除去气泡，同样要保持硅胶表面的平整。若担心上样及加溶剂过程中会将柱子表面弄破可考虑在上样前先在柱子上加一层石英砂。过程中时刻保持柱子不要干出气泡或裂纹！第60页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱洗脱柱层析所用的流动相，习惯上称为洗脱剂,可将目的组分自混合样品中逐次分离出来。洗脱的过程中，洗脱剂自柱上端加入,固定相上端始终在洗脱剂溶剂不能干，每30分钟－1小时内流出的洗脱剂体积等于所用吸附剂的重量为宜。洗脱剂可随意变，混合过渡为重点。根据需要分段收集，然后用薄层色谱检测。第61页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱洗脱剂在柱色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和洗脱剂之间发生吸附-溶解分配，强极性洗脱剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性洗脱剂对极性小的有机物溶解的多，随洗脱剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为洗脱剂只洗脱了混合物中一种化合物，对其它组分不能洗脱，需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的洗脱剂可以将各组分分离。第62页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱加压柱色谱利用各种装置施加压力进行的液相色谱，压力可高达100bar。可允许在分离过程中使用颗粒度更小的吸附剂，从而获得更高的分辨率。可加快洗脱剂的流速缩短分离时间。在对敏感化合物进行长时间的常压色谱分离时，化合物的结构可能会发生转变，而缩短分离时间的最大优点在于可以避免这种转变的发生。第63页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱加压柱色谱根据分离中所用压力的大小可把制备型柱色谱区分为快速色谱（约2bar）、低压液相色谱（＜bar）。中压液相色谱（5—20bar）及高压液相色谱（＞20bar)低压、中压与高压液相色谱的压力范围之间会存在一定交叠。分离中所用色谱柱及固定相颗粒的大小需根据分离的难易程度而定。一般对于难分离的样品应采用小颗粒的固定相及稍长的色谱柱分离所需压力也会加大。第64页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱加压柱色谱——快速色谱Still等于1978年介绍了快速色谱技术。色谱分离时长时间的洗脱可造成敏感化合物的分解并使色带脱尾，快速色谱大大缩短分离所需时间从而避免产生上述问题。快速色谱中使用最广泛的固定相为硅胶。一些粒度范围较窄的球形硅胶是专门为快速色谱而设计的。此外也可采用具有一定粒度范围的非球形硅胶。硅胶快速色谱可对天然产物进行最终纯化，但更常见的是用此方法对粗提物或混合物进行初步纯化，然后再利用其他具有高分辨率的色谱技术进行纯化。第65页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱

加压柱色谱——快速色谱快速色谱分离装置包括一装有活塞，长度适合的玻璃柱。可用干法或湿法将固定相加入其中。干法装柱效果更好，但需用大量溶剂使固定相完全润湿。在固定相的顶部最好加一层沙子。第66页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱固定相的上端应留有足够的空间以便反复加入洗脱剂，也可在柱顶部加一球形磨口储液槽。加样后可施加高于大气压lbar的压力以加速样品的洗脱。在气体入口处可利用一针式阀门控制压缩气体的流速。利用不同尺寸的色谱柱对0.01~10.0g样品所进行的分离通常可在15min内完成。加压柱色谱——快速色谱第67页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱使用最广泛的低压液相色谱系统是EMerck公司生产的Lobar柱系列产品，一般与其他分离方法结合起来使用，将其用作中间或最后的纯化手段。预制色谱柱是由玻璃制成，色谱柱中的固定相被柱两端的熔融玻璃封闭。色谱柱两端连有聚四氯乙烯环的金属管可与输液泵相连，金属管及聚四氯乙烯环被柱端的旋钮固定于柱体。加压柱色谱——低压柱色谱

第68页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱因分离过程中需使用输液泵一般采用组成恒定的洗脱剂。利用反相LobarRP18色谱系统从山甘草中分离得到三萜皂苷类成分，所用溶剂系统为乙醇-水（1:1）和乙腈-水（1:1）加压柱色谱——低压柱色谱

第69页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱加压柱色谱——低压柱色谱

Lobar柱规格分为A、B、C三种型号预制色谱往的填料有硅胶、RP－18、RP-8、NH2-、CN-及diol键合相硅胶等。第70页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱加压柱色谱——中压柱色谱

Lobar色谱分离系统具有使用方便，分辨率较高的优点。然而，用这些色谱柱难以分离5g以上的样品。中压液相色谱可采用更长、具有更大内径的色谱柱，可以一次性分离更多的样品。中压液相色谱比低压液波相色谱使用的填料颗粒度更小，分辨率更高，需使用更大的压力来维持适当的流速所需压力可由压缩空气或往复泵提供。先利用分析型HPLC可以十分有效地选择适当的溶剂系统。第71页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱加压柱色谱——中压柱色谱

中压色谱柱可用于分离100mg至100g的样品。活塞泵及可替换泵头可在最大压力为40bar时，使流速在3~160mL／min之间调节。该系统接有溶剂梯度形成装置并可用各种紫外检测仪检测。柱体大小可从130mL直至1880mL。第72页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱加压柱色谱——中压柱色谱

该系统的色谱柱由带有塑料保护膜的强化玻璃制成，因此可以观测到分离的进展情况。可以将色谱柱连接起来使用以提高分离能力。可以用干法或湿法装柱。与湿法装柱相比，干法装柱可使固定相填充密度提高20％。最大承受压力只有40bar，但使用颗粒度为15μm的固定相可以获得同HPLC柱类似的分离效果。第73页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱加压柱色谱——中压柱色谱

应用键合相固定相时应采用湿法装柱。可以用注射器将样品直接加到色谱柱上或使用进样器进样。如在色谱柱前连接一小的样品柱，也可以采用固体上样法。在制备型色谱柱前连一前置柱，在每次分离后将被污染的填料除去，利用甲醇—乙酸乙酯—已烷的冲洗顺序对硅胶固定相进行再生。但在重复使用几次之后，应将固定相废弃。键合相色谱柱更易于清洗井具有更长的使用寿命。分离中多数采用的是硅胶或反相硅胶固定相但有时也采用聚酰胺或纤维素第74页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱减压柱色谱

是利用真空为动力来加速流动相流经固定相的一种色谱分离方法。可用减压液相色谱法替代快速色谱法在进行高压液相色谱及其他复杂分离之前对植物提取物进行初步分离。与制备薄层色谱和快速色谱相比，设备简单，分离全程短，有较理想的分离度，分离容量大。类似于制备型薄层色谱，在完成一次展开、干燥后，还可再次对之进行展开。已有多种吸附剂被尝试用于减压液相色谱分离，其中包括硅胶、氧化铝、聚酰胺及健合相硅胶等。例如：用减压液相色谱法分离姜（Zingiberofficinale）中的辛辣成分，可将姜醇与姜烯酚完全分开。第75页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱减压柱色谱

操作方式是在一装有熔融玻璃（10－20μm，D型孔径或2号孔径）的短住或布氏漏斗中干法加入吸附剂（10~40μm薄层色谱用吸附剂，如Merck硅胶60H或60G），轻轻敲击装置，使吸附剂在重力作用下沉降。然后通过三通活塞抽真空并用一橡皮塞压紧吸附剂，直至吸附剂变得坚硬。放气之后，快速向吸附剂的表面加入低极性的溶剂，并继续抽真空。当溶剂流经全部柱体后。将柱抽干，即可准备上样。可将样品溶于适当的溶剂中直接加在柱上部，然后减压小心地将样品抽入吸附剂。第76页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱减压液相色谱另外也可将样品先吸附于硅胶、氧化铝或硅藻土上。洗脱剂的选择应适当先用低极性溶剂，然后再逐渐增大溶剂极性．在收集每份馏分后将柱体抽干（可减少馏分之间的相互交叉）。已有多种吸附剂被尝试用于减压液相色谱分离，其中包括硅胶、氧化铝、聚酰胺及健合相硅胶等。减压液相色谱不同于快速柱色谱，因该方法在收集每份馏分后允许色谱柱流干。减压液相色谱因其操作简便、分离速度快、分辨率高而在天然产物研究中获得广泛应用。第77页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱干柱色谱将干的吸附剂装入色谱柱中，待分离的样品配成浓溶液或吸附于少量填料上，然后上样。洗脱液依靠毛细作用流经色谱柱，当接近色谱柱底部时，停止洗脱，将吸附剂从柱中挖出用适当的溶剂将各色带中的成分洗出的色谱操作方法。在干柱色谱中，没有洗脱液从色谱柱流出，色带明显分开，耗时短且节省溶剂。可利用具有相同吸附剂的分析型薄层色谱来推测干柱色谱分离的效果。第78页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱干柱色谱实际上只是制备型薄层色谱形式上的变化，具有相同的分辨能力。先利用薄层色谱选择最佳的溶剂系统，然后进行干柱色谱分离。在使用混合溶剂系统进行干柱色谱分离时，可能达不到分析型薄层色谱所显示的分辨力，这时可在装柱前用10％的流动相对干柱的吸附剂进行预饱和。最佳的干柱是尼龙柱。根据展开的色带位置，可用刀将色谱柱或管切成若干段，然后把被分开的化合物用溶剂提取出来并进行过滤。尼龙柱的另一优点是可在紫外灯下观测到无色的色带，以此来指导切割。第79页，共88页，2023年，2月20日，星期二色谱分离法——柱色谱干柱色谱填充剂是决定柱效的主要因素，填充剂的颗粒直径越小直径范围越小，柱的效能越高；填装均匀，分离的层带才会整齐；若颗粒太小，流速减慢，则传质缓慢同时移动相线速度减慢，引起纵向扩散，影响分离度；使用过长的柱会引起移动相流速减