神经干细胞增殖中非必需氨基酸与β-巯基乙醇的作用研究,细胞生物学论文

神经干细胞增殖中非必需氨基酸与β-巯基乙醇的作用研究,细胞生物学论文神经干细胞〔NSCs〕广泛存在于胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统，是一类具有分裂潜能和自我更新能力的前体细胞，它能够通过对称分裂和不对称分裂方式进行自我更新并产生神经组织的各类细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等[1].NSCs的发现为神经系统变性、损伤性疾病的修复、治疗开拓了新途径。已有研究表示清楚，非必需氨基酸〔NEAA〕和-巯基乙醇能够促进小鼠胚胎干细胞向NSCs转化[2],但当前尚无NEAA和-巯基乙醇对孕14.5d来源胎鼠的NSCs作用的相关报道。本文进行了相关讨论。1材料与方式方法。1.1材料实验动物：孕14.5d雌鼠购于昆明医科大学实验动物中心，合格证号：SCXY〔滇〕-2020004.试剂：达尔伯克改进伊格尔培养基-F12营养混合物〔DMEM-F12〕培养基，神经基础培养基〔NeuronalBase〕,NEAA,-巯基乙醇，青/链霉素〔P/S〕,谷氨酸混合物，0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸〔Trypsin-ED-TA〕,胎牛血清〔FBS〕,牛血清蛋白〔BSA〕均购自Gib-co公司。B27,噻唑蓝〔MTT〕购自Sigma公司。表皮细胞生长因子〔EGF〕,碱性纤维生长因子〔bFGF〕,巢蛋白〔Nestin〕,神经元Ⅲ类微管蛋白〔TUJ-1〕,胶质纤维酸性蛋白〔GFAP〕购自Millipore公司。PCR逆转录试剂盒购自宝生物工程有限公司，其他RT-PCR试剂购自ABI公司。甘油醛-3-磷酸脱氢酶〔GAPDH〕及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3〔Caspase-3〕基因引物由Invitrogen公司合成。GAPDH:F:5-GCT-TCGGCAGCACATATACTAAAAT-3R:5-TTGGCTC-CACCCTTCAAGTG-3.Caspase-3:F:5-ACCGAT-GTCGATGCAGCTAA-3R:5-GGTGCGGTAGAGTA-AGCATA-3.1.2培养基的配制NSCs原代培养基：向DMEM/F12培养基内参加2mmol/LGlutaMAX,2mmol/LP/S,4mmol/LB27,20ng/mLEGF和20ng/mLbFGF.NSCs传代培养不含P/S,其余与原代培养基一样。NSCs贴壁培养基：向DMEM/F12培养基内参加50%NeuronalBase、1%BSA、2mmol/LGlutaMAX、4mmol/LB27、20ng/mLEGF和20ng/mLbFGF.NSCs分化培养基：向DMEM/F12培养基内参加50%NeuronalBase、0.5%FBS、2mmol/LGlu-taMAX、4mmol/LB27.1.3小鼠NSCs的分离和培养取孕龄为14.5d的雌鼠，三溴乙醇安泰死后无菌操作取出胎鼠前脑的侧脑室颗粒下层〔SVZ〕,剪碎，使用400L的0.05%Trypsin-EDTA于37℃消化10min,每5分钟吹打1次，使用DMEM-F12培养基终止消化。将细胞悬液在12000g、4℃离心10min,弃上清，使用1mLNSCs原代培养基重悬细胞后将NSCs种于12孔板。体外培养7d,NSCs会构成生长成熟的神经球，将生长成熟的神经球进行传代。详细操作：将神经球吸入到1.5mL离心管，800g、4℃离心5min,弃上清，使用400L胰酶消化3min,使用DMEM-F12培养基终止消化。将细胞悬液在800g、4℃离心5min,弃上清，使用NSCs传代培养基重悬细胞，细胞计数，以2105/孔将NSCs种于12孔板，每孔含传代培养基1mL.传代的NSCs在体外培养3d会构成成熟的神经球，继续将神经球传代。5~7代NSCs用于本实验。1.4分组及NSCs的处理NSCs传代后以2105/孔种于12孔板，分为四组，对照组：参加磷酸盐缓冲液〔PBS〕12NEAA组：参加NEAA10L,PBS2-巯基乙醇组：参加-巯基乙醇2L,PBS10NEAA+-巯基乙醇组：参加NEAA10L,-巯基乙醇2L.NEAA浓度为1%,-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L.NSCs以1.0105/孔种于多聚鸟氨酸〔0.01%〕包被过的24孔板，每孔参加0.5mLNSCs贴壁培养基，体外培养48h,进行免疫组化染色，对NSCs鉴定。本试验所用细胞为传代5~7代的NSCs,所有细胞能染色Nestin,提示我们所用细胞为NSCs.1.5NSCs增殖速度的测算用于实验的NSCs使用传代培养基以2105/孔种于12孔板，按分组给予处理〔同1.4〕,并悬浮培养。48h后收集神经球，吹散，消化后使用血细胞计数器进行活细胞计数。增殖速度=48h后收集的活细胞数/2105.1.6NSCs增殖率的测算采用MTT法。NSCs以0.1105/孔种于多聚鸟氨酸〔0.01%〕包被过的96孔板，每孔参加0.2mLNSCs贴壁培养基并按分组给予处理〔同1.4〕,体外培养48h,参加5mg/mL的MTT在37℃作用4h,去除培养基，参加二甲基亚砜150L/孔，室温下摇床上孵育15min,使用酶标仪〔TurnerBioSys-tems公司〕450nm测定吸光度〔A值〕.1.7NSCs中Caspase-3mRNA的检测采用RT-PCR法。用于实验的NSCs使用传代培养基培养，并进行分组及处理〔同1.4〕.48h后收集神经球，参加总RNA抽提试剂，提取总RNA.其余步骤按试剂盒讲明书进行。1.8GFAP、Nestin阳性细胞数的测算采用免疫组化染色法。NSCs以0.5105/孔种于多聚鸟氨酸〔0.01%〕包被过的24孔板，每孔参加0.5mLNSCs分化培养基，体外培养7d,进行免疫组化染色〔TUJ-1、Nestin、GFAP〕,对NSCs向神经元和星形胶质细胞分化比例进行测定。详细步骤按试剂盒讲明操作，镜下观察，拍片。ImageJ软件计算阳性细胞所占百分比。1.9统计学方式方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以珋xs表示，多组间比拟用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。2结果。各组NSCs增殖速度、细胞增殖率、Caspase-3mRNA、TUJ-1阳性细胞、GFAP阳性细胞、Nestin阳性细胞比拟见表1.3讨论。近年随着我们国家人口的迅速老龄化，中枢神经系统退行性疾病日益增加。固然当前已有研究报道利用NSCs移植治疗阿尔茨海默病、亨廷顿病、多发性硬化、中风、脊髓损伤等神经退行性疾病[3,4],但是NSCs移植治疗始终存在免疫排挤[5]和伦理学的挑战。1992年Reynolds等[6]从成年鼠的纹状体和海马中分离出NSCs,确定在成熟的中枢神经系统有NSCs的存在。神经损伤后，通过内源性及外源性刺激，促进神经新生，即促进机体本身的NSCs增殖、分化以修复受损的组织是NSCs研究的主要目的[7].寻找安全有效的药物来促进自体神经新生一直是NSCs研究者努力的方向。本研究中我们选择孕14.5d的雌鼠，提取其胎鼠的前脑SVZ区经胰酶消化后获得NSCs进行培养。假如雌鼠的孕期短于14d,其胎鼠的脑发育差，脑体积小，脑组织不饱满，完好地提取胎鼠前脑的实验操作难度加大。更重要的是，由于发育时间短，胎龄过小的胎鼠脑提取出的NSCs数量少、质量差，难以长期传代。假如胎龄大于15d,NSCs已经开场向神经元发育，NSCs的增殖能力差会影响实验结果，造成较大实验偏差。细胞活性的高低能够反映细胞的增殖能力[8].细胞增殖速度是衡量细胞增殖的另一项常用指标。本研究中NEAA+-巯基乙醇组细胞增殖率及增殖速度最高，NEAA组及-巯基乙醇组高于对照组。讲明NEAA和-巯基乙醇均具有促进NSCs增殖的作用，联合作用效果更佳。Caspase-3是细胞凋亡经过中最主要的终末剪切酶[9],其裂解活化直接导致细胞死亡[10].本研究发现，1%NEAA和0.1mmol/L-巯基乙醇均可降低Caspase-3mRNA表示出，联合作用效果更强。提示NEAA和-巯基乙醇均具有抑制NSCs细胞凋亡的作用。本研究中的-巯基乙醇组及NEAA+-巯基乙醇组TUJ-1、GFAP阳性细胞百分比均降低，Nestin阳性细胞百分比升高，以NEAA+-巯基乙醇组为着，提示-巯基乙醇具有抑制NSCs向神经元及星形胶质细胞分化的作用，以联合应用效果更佳。〔表略〕以下为参考文献：[1]GuoW,PatzlaffNE,JobeEM,etal.Isolationofmultipotentneu-ralstemorprogenitorcellsfromboththedentategyrusandsubven-tricularzoneofasingleadultmouse[J].NatProtoc,2020,7〔11〕:2005-2020.[2]Freitas-CorreaL,LourencoMV,AcquaroneM,etal.2,4-Dinitro-phenolinducesneuraldifferentiationofmurineembryonicstemcells[J].StemCellRes,2020,11〔3〕:1407-1416.[3]HedayatpourA,RagerdiI,PasbakhshP,etal.Promotionofremyeli-nationbyadiposemesenchymalstemcelltransplantationinacuprizonemodelofmultiplesclerosis[J].CellJ,2020,15〔2〕:14