如何做好免疫印迹

如何做好免疫印迹第1页，共52页，2023年，2月20日，星期四印记法印迹（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用探测物特异性检测未知样品的方法。1975年，Southern将DNA转印到硝酸纤维素（NC）膜上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段，后来称这种方法为Southern印迹法。第2页，共52页，2023年，2月20日，星期四印记法SouthernBlotNorthernBlotWesternBlotFarWesternBlotDotBlot？DNARNAProtein第3页，共52页，2023年，2月20日，星期四Western-blot高灵敏度、高特异性的蛋白检测应用于绝大多数生物、医学实验室成熟的技术、丰富的方案选择第4页，共52页，2023年，2月20日，星期四主要步骤样品制备电泳转膜封闭结合抗体发光（显色）信号检测第5页，共52页，2023年，2月20日，星期四样品制备细胞裂解蛋白溶解（可一步完成）蛋白定量第6页，共52页，2023年，2月20日，星期四细胞裂解离子型去垢剂（SDS）非离子型去垢剂（N-P40，TritonX-100）Tris、NaCl、叠氮化钠、正钒酸钠等蛋白酶抑制剂EDTA、PMSF、PIcocktail等超声研磨匀浆反复冻融第7页，共52页，2023年，2月20日，星期四LaemmliSampleBuff.(161-073730ml)62.5mMTris-HCl,pH6.8,2%SDS,5%b-ME,25%Glycerol,0.01%Bromophenolblue变性蛋白NativeSampleBuff.(161-073830ml)62.5mMTris-HCl,pH6.8,40%Glycerol,0.01%Bromophenolblue非变性蛋白35mm小盘：250ml30mm中盘：500ml100mm大盘：1ml检测磷酸化蛋白：再加入Na3VO40.1mM及NaF25mM

样品制备——缓冲液TricineSampleBuff.(161-073930ml)200mMTris-HCl,pH6.8,2%SDS,40%Glycerol,0.04%Coomassieblue多肽第8页，共52页，2023年，2月20日，星期四蛋白的定量用于蛋白的快速定量方法主要有A280法、Bradford法、Lowry法三种方法，其中A280法灵敏度为0.2-2mg/ml，但核酸可引起强干扰作用；Lowry法灵敏度为5-100μg/ml，虽相对准确，但干扰物质多且反应速度慢，而且含DTT溶液不宜用此法；Bradford法灵敏度为25-200μg/ml，由于相对干扰物质较少，且反应时间仅需2分钟,故适合用于大多数研究的蛋白定量。Bio-rad另有对一种适用于去垢剂增溶蛋白样品的比色测定的试剂盒DCProteinAssayKit，该方法类似于常规的Lowry方法，但经过改良后，节省了操作时间。DC蛋白测定只需要15分钟的温育时间，而且吸收值读数保持2小时的稳定。RCDCProteinAssayKit蛋白测定是一种适用于含还原剂和去垢剂的蛋白测定，具有原来DC蛋白测定的特点，并能与更多的试剂兼容，简化了复杂蛋白样品溶液的定量测定。第9页，共52页，2023年，2月20日，星期四

特殊的兼容物----DetergentReducer&.Detergent样品制备——定量第10页，共52页，2023年，2月20日，星期四•200–800nm•Scanningmode•Standardcurves•Kinetics•Directdisplay•PrinterSmartSpecplus™SpectrophotometerProteinAssayRCDC™

ProteinAssay•ReducingagentcompatibleDetergentcompatible第11页，共52页，2023年，2月20日，星期四电泳第12页，共52页，2023年，2月20日，星期四基质及交联剂基质：

丙稀酰胺（Acrylamide）交联剂：

第13页，共52页，2023年，2月20日，星期四基质及交联剂T%＝C%＝蛋白SDS常用C％：1：29，1：37.5T%的线性分离范围：T％线性分离范围5％57～2127.5％36～9410％20～8012％12～6015％10～43C％=1:29第14页，共52页，2023年，2月20日，星期四非变性体系1×配方积层胶4％A/B,0.125MTris-HCl,pH6.8,0.1%AP,0.04%TEMED分离胶T％A/B,0.625MTris-HCl,pH8.8,0.1%AP,0.04%TEMED样品缓冲液62.5mMTris-HCI,pH6.8,40%甘油,0.01%溴酚蓝电极缓冲液25mMTris,192mM甘氨酸,pH8.3第15页，共52页，2023年，2月20日，星期四变性体系1×配方积层胶4％A/B,0.125MTris-HClpH6.8,0.1%SDS,0.1%AP,0.04%TEMED分离胶T％A/B,0.625MTris-HClpH8.8,0.1%SDS,0.1%AP,0.04%TEMED样品缓冲液62.5mMTris-HCI,pH6.8,2%SDS,25%甘油,0.01%溴酚蓝电极缓冲液25mMTris,192mM甘氨酸,0.1%SDS,pH8.3第16页，共52页，2023年，2月20日，星期四适合小分子蛋白分离的Tris-Tricine体系1×配方积层胶4％A/B,0.745MTris-HClpH8.45,0.1%AP,0.04%TEMED分离胶>10％A/B*,1MTris-HClpH8.45,0.1%SDS,0.1%AP,0.04%TEMED样品缓冲液200mMTris-HCI,pH6.8,2%SDS,40%甘油,0.04%考马斯亮蓝G-250电极缓冲液100mMTris,100mMTricine,0.1%SDS**建议选用C%=2.6%**可将阳极缓冲液换成0.2MTris,0.1%SDS第17页，共52页，2023年，2月20日，星期四预混电泳缓冲液PremixedElectrophoresisBuffers161-073210xTris/Glycine/SDS,1L161-077210xTris/Glycine/SDS,5Lcube161-0734

10xTris/Glycine,1L161-077110xTris/Glycine,5Lcube161-074410xTris/Tricine/SDS,1L第18页，共52页，2023年，2月20日，星期四SDS－主要设备第19页，共52页，2023年，2月20日，星期四PrecisionPlusProteinTM

蛋白标准品

条带窄而清晰，分子量准确（经质谱验证），可用于蛋白分子量测算；未预染的条带标记链亲和素(Streptavidin)亲和肽，可进行Western杂交检测；包括未预染(161-0363)，预染全蓝(161-0373)，双色(161-0374)和彩染(161-0375)每种标准品含10个条带，跨度从10KD－250KD。第20页，共52页，2023年，2月20日，星期四未染标准品

——分子量测定Fig.1.ApproachforMWdeterminationofanunknownprotein.Lane1,10µlofPrecisionPlusProteinunstainedstandards;lanes2–7,adilutionseriesofanE.colilysatecontainingahypotheticallyunknownprotein(GFP).ProteinswereseparatedbyCriterion4–20%Tris-HClgelandstainedwithBio-SafeCoomassiestain.第21页，共52页，2023年，2月20日，星期四PrecisionPlusProteinTM

预染标准品r2＝0.996第22页，共52页，2023年，2月20日，星期四转印第23页，共52页，2023年，2月20日，星期四印迹膜硝酸纤维素(NC)膜：历史悠久，蛋白结合力不强，载量较低

·Nitrocellulose:载量80-100mg/cm2，孔径0.2/0.45mm聚偏四氟乙烯(PVDF)膜：蛋白结合力强，载量较大，使用广泛

·Immuno-BlotTM:载量150-160mg/cm2，适于反复洗脱。孔径0.2mm

·Sequi-BlotTM

：载量170-200mg/cm2，蛋白结合更牢固，可用于蛋白测序或小分子转印，孔径0.2mm尼龙(Nylon)膜:带正电荷，结合力最强，载量最大，尤其适于很小分子转印和生物素显色

·Zeta-Probe®:载量480mg/cm2，蛋白结合最牢固，封闭只需5％脱脂奶粉第24页，共52页，2023年，2月20日，星期四缓冲液Towbin缓冲液:25mMTris,192mM甘氨酸,20%(v/v)甲醇.Towbin缓冲液+SDS:25mMTris,192mM甘氨酸,0.1%SDS,20%(v/v)甲醇.CAPS缓冲液:10mMCAPS,10%甲醇.乙酸缓冲液:0.7%乙酸第25页，共52页，2023年，2月20日，星期四不同蛋白须用不同缓冲体系和膜蛋白测序Towbin,CAPSNC,PVDF高分子蛋白Towbin-SDS,CAPSNC,pH!小分子蛋白或肽Towbin,CAPSNC,PVDF碱性蛋白(pI>9)在SDSCAPS,碳酸-BjerrumS-NielsenNC,PVDF碱性蛋白(pI>9)在native0.7%HACNC,PVDF糖蛋白Towbin,CAPS-SDS/-,碳酸盐,Bjerrum,S-NielsenNC,PVDFproteoglycansTowbin,Bjerrum,S-NielsenNC,PVDF第26页，共52页，2023年，2月20日，星期四槽式转印系统（湿转）MiniTrans-Blot转印槽2. Criterion转印仪Trans-Blot转印槽Trans-BlotPlus转印槽半干转印系统Trans-BlotSD半干转印槽微量过滤及筛选系统Bio-Dot和Bio-Dot微量过滤器Mini-ProteanII多道筛选仪真空转印系统785型真空转印仪(DNA&RNA转印至尼龙膜)转印设备电转印第27页，共52页，2023年，2月20日，星期四电转印+- Anode MembraneGel

Cathode电场强度决定转印的效率

场强越高，转印越快电场强度又取决于电极间距离距离越短，场强越高.第28页，共52页，2023年，2月20日，星期四半干转印特有的不连续转印缓冲液被隔绝，允许正、负极间缓冲液不同阴极(胶面)缓冲液含0.1%SDS，不含甲醇，利于转印阳极(膜面)缓冲液不含SDS，含20％甲醇，防止转过配合PVDF膜可提高转膜效率，减少损失第29页，共52页，2023年，2月20日，星期四*5×储液：36.34gTris,44.26gCAPS,加水至1L一个新型不连续转膜体系缓冲液：

1.5mA/cm2(电压不超过25V)，转印30-60min阴极缓冲液阳极缓冲液5×Tris-CAPS储液*20ml20ml10%SDS1ml--Methanol--15mlH2O79ml65ml第30页，共52页，2023年，2月20日，星期四巧妙的改进，出色的结果

左：10%SDSPAGE后用前述不连续缓冲体系半干转印，转印后印迹膜用考马斯蓝R250染色；中：转膜后凝胶考染；右：WesternBlot检测该印迹膜上p47蛋白。泳道1、2分别为Kaleidoscope蛋白标准品和细胞全蛋白1212216kD132kD第31页，共52页，2023年，2月20日，星期四特殊转印要求下仪器和试剂的选择应用转印缓冲液印迹膜推荐仪器蛋白测序CAPSPVDF/NC槽式转印大分子蛋白TowbinwithSDS,不连续体系PVDF/NC槽式转印小分子蛋白或多肽Towbin，CAPSPVDF槽式转印碱性(pI>9),变性胶CAPSNC/PVDF槽式/半干转印碱性(pI>9),非变性胶0.7%乙酸NC/PVDF槽式转印糖蛋白Towbin(withSDS),CAPSNC/PVDF槽式/半干转印蛋白多糖TowbinNC/PVDF槽式/半干转印第32页，共52页，2023年，2月20日，星期四两种转印系统的比较半干转湿转每块mini胶所需缓冲液的量~20ml500－700ml所需时间～30分钟(大分子量蛋白应适当延长)30~60分钟(很大分子量蛋白适当延长)冰浴不需要需要适用范围<150KD无限制第33页，共52页，2023年，2月20日，星期四电压,电流,功率设置恒电压时,电阻下降,电流加大,会产高热,须降温(半干除外)设置恒电流时,电压和功率随电阻下降而下降,产热也会降低,以后随场强下降,转印速度也会下降.设置恒功率时,电流随电阻下降而升高,升高的速度较恒电压时低,所以设置恒功率近似恒电流第34页，共52页，2023年，2月20日，星期四Semi-dryblotTransferminigelsfor15–30minutesat10–15V.Largegelscanbetransferredfor30minutesto1hourat15–25V.Donotexceed25Vwiththisinstrument.Acurrentlimit(3mA/cm2forlargegels;5.5mA/cm2forminigels)isrecommendedtopreventexcessiveheatingduringtherun.第35页，共52页，2023年，2月20日，星期四湿转第36页，共52页，2023年，2月20日，星期四第37页，共52页，2023年，2月20日，星期四第38页，共52页，2023年，2月20日，星期四用Bio-Dot或Bio-DotSF进行斑点或狭缝印迹直接真空抽滤上样至印迹膜方便快速，可高温消毒，适于高通量筛选第39页，共52页，2023年，2月20日，星期四转膜后检测丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。注：染色法不适合蛋白结合力较强的PVDF膜和尼龙膜第40页，共52页，2023年，2月20日，星期四封闭目的：封闭膜上多余的蛋白结合位点，减少非特异性反应封闭液

脱脂奶粉或BSA(5％)

溶于TBST(100mmol/LTris-Cl,9g/LNaCl,5g/LTween20)溶液中封闭时间：37℃一小时，4℃过夜第41页，共52页，2023年，2月20日，星期四常用封闭液试剂膜浓度备注明胶NC1-3%明胶加热溶解脱脂奶,BLOTTONC,PVDF0.5-5%PVDF所需浓度要高BSANC,PVDF1-5%PVDF所需浓度要高TWEEN20NC0.05-0.3%可能有杂带第42页，共52页，2023年，2月20日，星期四一抗、二抗孵育根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭液配制的一抗液与滤膜温育。37℃一小时，4℃过夜倒掉一抗溶液，用TBST液滤膜3次，每次5min加入用封闭液配制的二抗溶液，37℃一小时，4℃过夜倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3-5次，每次10min。第43页，共52页，2023年，2月20日，星期四印迹膜检测第44页，共52页，2023年，2月20日，星期四第45页，共52页，2023年，2月20日，星期四全蛋白检测－负离子染色主要有考马斯亮蓝-R250和氨基黑优点：廉价、快速，缺点：灵敏度低，膜易变形氨基黑染色背景较低，脱色容易，优于考马斯蓝第46页，共52页，2023年，2月20日，星期四