(3)-9.1分子克隆的定义及基本步骤

分子克隆（MolecularCloning)：指将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体中，导入宿主细胞，在宿主细胞中进行自我复制并得到大量完全相同的该DNA片段的“群体”。分子克隆的技术路线分切接转筛表载体DNA（vector）目的DNA（targetfragment）重组DNA（recombinantDNA）把需要研究的基因称为目的基因（靶基因或者插入基因）。要分离、改造、扩增或表达的基因。

如：生长激素基因、干扰素基因等。就是几千个或几百个甚至更少的碱基对的DNA片段。目的基因：分：分离得到目的基因需要克隆的DNA片段编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系目的基因大海捞针？聚合酶链反应人工合成基因目的基因来源构建基因组文库制备cDNA文库目的基因的获取已知基因未知基因目的基因聚合酶链反应技术（PCR）⑴引物设计；⑵引物效果检验和PCR参数确定。PCR可以把指定的基因片段数量放大基因组PCR基因放大连琐反应聚合酶链反应技术（PCR）人工合成基因1979年，Khornan等首次用化学的方法合成了一种具有生物活性的大肠杆菌酪氨酸转移酶核糖核酸基因，开创了基因化学合成的先例。目前常用的方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。要求：1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2、分子量较小的目的基因的制备1.直接合成基因寡聚核苷酸化学合成的优点（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA2.定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低目前，化学合成寡核苷酸片段的能力是150—200bp，绝大数基因，尤其是高等生物的基因，大小超过这个范围。可以通过各种方法拼接成几百bp到几千bp的DNA片段。价格！！！长度价格15~59base1.60/base90~100base5.00/base化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5’端是-OH）T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链2.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物构建基因组文库及cDNA文库

将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，因此，称之为基因组文库或基因文库。基因文库（genelibrary）组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌*从基因组DNA文库获取未知的目的基因筛选cDNAlibrarycDNA文库的构建利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。cDNA(complementaryDNA，互补DNA)是由生物