




版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
基因工程菌的发酵第1页,共30页,2023年,2月20日,星期四基因工程菌的稳定性基因工程菌的遗传不稳定性的表现基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性,这种不稳定性具有下列两种表现形式:
结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰,导致其表观生物学功能的丧失
分配不稳定性
整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸(curing)第2页,共30页,2023年,2月20日,星期四基因工程菌的稳定性基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解
外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应:关闭合成途径,启动降解程序
重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配这是重组质粒逃逸的基本原因
受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排第3页,共30页,2023年,2月20日,星期四基因工程菌的稳定性基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解
外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应:关闭合成途径,启动降解程序
重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配这是重组质粒逃逸的基本原因
受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排第4页,共30页,2023年,2月20日,星期四基因工程菌的稳定性重组质粒的逃逸率当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时,培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒,这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。
重组质粒逃逸的原因有:
高温培养、表面活性剂(SDS)、药物(利福平)、染料促使重组质粒渗漏受体细胞中的核酸酶降解重组质粒重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配,细胞所含重组质粒拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧第5页,共30页,2023年,2月20日,星期四
影响基因工程菌稳定性的因素载体的选择
遗传特性宿主的选择外源基因整合到宿主染色体上
培养基生长速率
发酵工艺限制性基质温度
pH和溶氧外源基因表达基因工程菌的稳定性第6页,共30页,2023年,2月20日,星期四
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括:
将R1质粒上的parB
基因引入表达型载体中其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞
正确设置载体上的多克隆位点禁止DNA片段插在稳定区内
将受体细胞的致死性基因安装在载体上同时构建条件致死性的相应受体系统,如大肠杆菌的ssb
基因(DNA单链结合蛋白编码基因)基因工程菌的稳定性第7页,共30页,2023年,2月20日,星期四培养基
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性
微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培养基中培养时,由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质,微生物的生长较在基本培养基中快。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响第8页,共30页,2023年,2月20日,星期四比生长速率
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。基因重组菌的比生长速率与培养环境有关,如温度,pH,溶氧,限制性营养物质浓度,有害代谢产物浓度等。在一定的温度和pH下,限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。培养条件对基因工程菌稳定性的影响第9页,共30页,2023年,2月20日,星期四限制性基质一般培养基中各成分并不是完全平衡的,经过一段时间的培养,微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响培养条件对基因工程菌稳定性的影响第10页,共30页,2023年,2月20日,星期四pH和溶解氧
pH和溶氧影响重组酵母菌的稳定性。
pH和溶氧是影响微生物生长的重要参数,在发酵罐培养基因重组菌时,通常都需要维持一定的pH和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时,为了维持所需的溶氧水平,除了提高搅拌转速和通气量,往往还要在通入的空气中补充氧气,以提高发酵罐的供氧能力。培养条件对基因工程菌稳定性的影响第11页,共30页,2023年,2月20日,星期四外源基因的表达
外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定外源基因高效表达时,有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动,并造成质粒不稳定。例如,吲哚丙烯酸(IAA)是trp操纵子阻遏物的部分去阻遏剂,在培养大肠杆菌MV12(pVH5)时,在培养基中加入不同量的IAA,发现随IAA量的增加,pVH5带有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表达水平有很大提高,同时比生长速率下降,培养液中Trp-
的比例上升。电泳分析表明60%~70%色氨酸合成能力丧失是由于质粒结构的变化,其余是由于质粒丢失造成。培养条件对基因工程菌稳定性的影响第12页,共30页,2023年,2月20日,星期四提高基因工程菌稳定性的策略施加选择压力
根据载体上的抗药性标记,向培养系统中添加相应的抗生素
药物和食品生产时禁止使用抗生素
加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素,只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力
载体上的营养缺陷型标记,向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂,成本较高
提高质粒稳定性的方法第13页,共30页,2023年,2月20日,星期四提高基因工程菌稳定性的策略
分阶段控制培养
因外源基因表达造成质粒不稳定时,可以考虑将发酵过程分阶段控制在生长阶段使外源基因处于阻遏状态,避免因表达造成不稳定性问题的发生;在获得需要的菌体密度后,再去阻遏或诱导外源基因表达。连续培养时可以考虑采用多级培养,如在第一级进行生长,维持菌体的稳定性,在第二级进行表达。
提高质粒稳定性的方法第14页,共30页,2023年,2月20日,星期四提高基因工程菌稳定性的策略
控制目的基因的过量表达使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度:较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
提高质粒稳定性的方法第15页,共30页,2023年,2月20日,星期四提高基因工程菌稳定性的策略
优化基因工程菌的培养工艺
工程菌的培养条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大可调控的环境参数为:培养基组分、培养温度、pH和溶解氧浓度。有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢,因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率,从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度:较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
提高质粒稳定性的方法第16页,共30页,2023年,2月20日,星期四提高基因工程菌稳定性的策略控制培养条件有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢,因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率,从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。例如研究表达干扰素a
的大肠杆菌W3110(pEC901)在不同比生长速率下的质粒稳定性,随着稀释率的增加,质粒稳定性明显增加,干扰素的比效价也明显增大.
提高质粒稳定性的方法第17页,共30页,2023年,2月20日,星期四
提高质粒稳定性的方法提高基因工程菌稳定性的策略固定化
固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性基因重组大肠杆菌进行固定化后,质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。在游离重组菌系统中常用抗生素,氨基酸等选择性压力稳定质粒的手段,往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后,这种选择压力则可被省去。不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。第18页,共30页,2023年,2月20日,星期四一、基因工程菌的培养方式二、基因工程菌的发酵工艺第七节基因工程菌的培养第19页,共30页,2023年,2月20日,星期四基因工程菌发酵的基本操作方式有:
分批培养
分批培养操作简单,但因不能控制生长,获得的菌体密度也有限
半连续培养(补料分批)在一次投料发酵的基础上,流加一定量的营养,使细胞进一步的生长,或得到更多的代谢产物
连续培养不断地流加营养,并不断地取出发酵液。
连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。
透析培养
固定化培养基因工程菌培养方式第20页,共30页,2023年,2月20日,星期四补料分批培养补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间,间歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体进一步生长的培养方法。在分批培养中,为保持基因工程菌生长所需的良好微环境,延长其生长对数期,获得高密度菌体,通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来,根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。基因工程菌培养方式第21页,共30页,2023年,2月20日,星期四连续培养连续培养是将种子接入发酵反应器中,搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后,开动进料和出料蠕动泵,以一定稀释率进行不间断培养。连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境,控制其比生长速率,为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了良好的条件。但是由于基因工程菌的不稳定性,连续培养比较困难。为了解决这一问题,人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开,进行两阶段连续培养。在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定,菌体进入第二阶段后可获得最高表达水平或最大产率。基因工程菌培养方式第22页,共30页,2023年,2月20日,星期四透析培养透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离,其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液抽出打入罐外的膜透析器的一侧循环,其另一侧通入透析液循环,在补料分批培养中,大量乙酸在透析器中透过半透膜,降低培养基中的乙酸浓度,并可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度,从而获得高密度菌体。膜的种类、孔径、面积,发酵液和透析液的比例,透析液的组成,循环流速,开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响。基因工程菌培养方式第23页,共30页,2023年,2月20日,星期四固定化培养基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域,发现基因工程菌经固定化后,质粒的稳定性大大提高,便于进行连续培养,特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点,基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。基因工程菌的培养方式第24页,共30页,2023年,2月20日,星期四基因工程菌的培养设备
应用发酵罐来大规模培养基因工程菌。为了防止工程菌丢失携带的质粒,保持基因工程菌的遗传特性,因而对发酵罐的要求十分严格。由于生化工程学和计算机的发展,新型自动化发酵罐完全能满足这些要求。常规的微生物发酵设备可直接用于基因工程菌的培养。不同点在于,微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物,细胞生长并非主要目标。基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。由于这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质,因此,
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 从基因组学到疾病治疗的新技术与仪器研究报告
- 小学工会工作计划
- 儿童英语教育市场分析报告
- 新课程背景下小学语文教学中的情境创设实践-以《大自然的声音》为例
- 中药文化传承与现代应用探索
- 全国人教版信息技术七年级下册第三单元第15课一、《调整色阶》教学设计设计
- 第15课 钢铁长城(教学设计)八年级历史下册同步备课系列(部编版)
- Unit 1 Section A 1a-1b 教学设计 2024-2025学年人教版八年级英语下册
- 临时用电安全管理协议书范本
- 家装设计公司装修协议书
- 企业投融资决策与管理考核试卷
- 消防安全知识培训-课件
- 中国高血压防治指南(2024年修订版)解读课件
- 酒店安全紧急疏散预案
- 混合碳酸稀土项目立项申请报告
- 2024-2030年中国马铃薯全粉行业市场深度调研及发展前景与投资研究报告
- 2024安全员知识考试题(全优)
- 高考招生咨询服务合同
- 玻璃加工工艺流程单选题100道及答案解析
- DB11T 213-2014 城镇绿地养护管理规范
- 2022电力监控系统网络安全监测装置说明书
评论
0/150
提交评论