多聚酶链式反应技术

多聚酶链式反应技术第1页，共53页，2023年，2月20日，星期四一、PCR技术概念：是一种体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用：第2页，共53页，2023年，2月20日，星期四DNA复制原理第3页，共53页，2023年，2月20日，星期四①在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链;③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器.二、PCR技术的原理第4页，共53页，2023年，2月20日，星期四DNA双链单链变性（加热95℃

）复性（缓慢冷却55℃

）4、DNA分子的热变性原理：变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合第5页，共53页，2023年，2月20日，星期四三、使用PCR的前提是：已知目的基因(或DNA片段)两侧的序列，根据该序列化学合成反应必需的双引物。

PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。

第6页，共53页，2023年，2月20日，星期四四、PCR条件：

四种脱氧核苷酸;耐高温的DNA聚合酶;两种引物;模板；缓冲溶液严格控制温度的温控设备。第7页，共53页，2023年，2月20日，星期四

DNA的复制体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入解旋解旋酶加热变性引物引物合成酶外源加入底物细胞内源外源加入DNA聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液第8页，共53页，2023年，2月20日，星期四碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’-OH端为3’

磷酸基团的末端为5’

复制的方向：子链的5’

端向3’端延伸第9页，共53页，2023年，2月20日，星期四温泉中水生嗜热杆菌第10页，共53页，2023年，2月20日，星期四

DNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在1000C条件下，能保持几个小时。而其最适温度在720C左右。

第11页，共53页，2023年，2月20日，星期四第12页，共53页，2023年，2月20日，星期四

引物

引物是决定PCR结果的关键。*引物长度以15～30个碱基为宜，引物过长会影响与模板的退火效率。*(G＋C)含量最好保持在约40%～60%，(G＋C)含量越高退火温度越高，退火温度过高过低都不利于PCR的反应。*两个引物之间不应发生互补。*引物浓度要适宜.用低浓度引物不仅经济，反应特异性也较好。第13页，共53页，2023年，2月20日，星期四

快速、高效、灵活、易于操作五、PCR技术的特点六、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液第14页，共53页，2023年，2月20日，星期四体内DNA复制和PCR不同点解旋（解旋酶；高温解旋）引物（RNA；人工合成的DNA单链）DNA聚合酶（耐不耐高温）反应环境（细胞内环境；缓冲溶液）第15页，共53页，2023年，2月20日，星期四六、PCR的反应过程1、PCR的反应步骤

PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性（模板DNA解旋）

模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备.2、循环过程第16页，共53页，2023年，2月20日，星期四靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性第17页，共53页，2023年，2月20日，星期四②复性（退火）

模板DNA经加热变性成单链后，温度降到550C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合第18页，共53页，2023年，2月20日，星期四靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火第19页，共53页，2023年，2月20日，星期四③延伸

DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链.第20页，共53页，2023年，2月20日，星期四靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸第21页，共53页，2023年，2月20日，星期四靶序列靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列第22页，共53页，2023年，2月20日，星期四循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循环后靶序列扩增的数量第23页，共53页，2023年，2月20日，星期四七、PCR循环的结果

②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增;

①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸;第24页，共53页，2023年，2月20日，星期四八、PCR的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次第25页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR仪第26页，共53页，2023年，2月20日，星期四微量离心管微量移液器第27页，共53页，2023年，2月20日，星期四（二）、PCR的反应过程每个循环包括：变性——复性——延伸

从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。第28页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR循环--变性第29页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR循环--变性第30页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR循环--变性第31页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR循环—复性第32页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR循环—延伸第33页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR循环—延伸第34页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR循环—延伸第35页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR循环—延伸第36页，共53页，2023年，2月20日，星期四第37页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR整个过程第38页，共53页，2023年，2月20日，星期四

反应程序

95℃5分钟，1个循环；

95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环；

72℃

延伸7分钟。反应产物在4℃保存。反应结束后用紫外分光光度计测定扩增产物的DNA含量或用琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况。

第39页，共53页，2023年，2月20日，星期四循环数变性复性延伸第一次95°C，10min－－30次９5℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９5℃，1min55℃，30s72℃，1min第40页，共53页，2023年，2月20日，星期四讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度DNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶第41页，共53页，2023年，2月20日，星期四紫外分光光度计测定PCR产物含量将PCR产物10倍稀释后，用蒸馏水做空白对照，在260nm处测定稀释后PCR产物的吸光值（A260nm），根据下面的公式计算DNA含量。DNA的浓度(μg/ml)=A260nm0.02×稀释倍数1μg/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02。第42页，共53页，2023年，2月20日，星期四

123M45

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳1，2，4，5：PCR产物；3，阴性对照；M,DNA分子量标准（从上向下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）第43页，共53页，2023年，2月20日，星期四PCR技术与体内DNA复制的区别：1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。第44页，共53页，2023年，2月20日，星期四练习巩固1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定第45页，共53页，2023年，2月20日，星期四2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是A原理简单B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐热性D快速、高效、灵活、易于操作第46页，共53页，2023年，2月20日，星期四4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A反复洗涤B不怕外源DNA污染C高压灭菌D在—20℃储存第47页，共53页，2023年，2月20日，星期四实验小结

PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72℃第48页，共53页，2023年，2月20日，星期四三、实验步骤：准备好PCR反应体系的配方用微量移液器按