碱性磷酸酶的分离纯化-袁野20101009课件

碱性磷酸酶(AKP)的分离纯化生物化学与分子生物学系袁野实验目的:从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验，培养同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。实验原理：采用有机溶剂分步沉淀法，从兔肝中提取碱性磷酸酶。AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。常用的有机溶剂沉析剂乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；特点：介电常数小:60%乙醇的介电常数是48

丙酮的介电常数是22容易获取有机溶剂沉析的特点分辨率高；溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在低温下操作；影响有机溶剂沉析的主要因素温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；搅拌速度：散热溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（pI）离子强度:离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L样品浓度:0.5~2% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅拌2min，室温放置30min，纱布过滤，置于离心管。滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后3000r/min5min。弃上清，沉淀用4ml0.5MMg(AC)2溶解。记录体积b。取0.1ml作为B液于EP管，待测比活性用。4.(1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min5min，转移上清于另一离心管。(2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min5min，弃上清，沉淀用4ml0.01MMg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。5.(1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min5min，转移上清于离心管，弃沉淀。(2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min5min，弃上清，沉淀用3ml0.5MMg(AC)2溶解,记录体积c。取0.1ml作为C液于EP管,待测比活性用。用于活性测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将A液稀释25倍、B液稀释10倍、C液稀释5倍，D液不稀释。用于含量测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将A液稀释50倍、B液稀释20倍、C液稀释5倍，D液不稀释。(二)碱性磷酸酶的活性测定实验原理：AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适pH范围为8.8~10,需要镁离子作为激活剂。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。磷酸苯二钠磷酸盐+酚AKP酚+4-氨基安替比林红色醌类衍生物铁氰化钾管号空白标准ABCD酶液体0.10.10.10.1酚标准液0.1Tris-Mg(AC)20.1复合底物3.03.03.03.03.03.01.取试管6支编号（体积单位为ml）2.加入底物后,立即混匀,37℃准确15min后加入0.5%铁氰化钾2.0ml终止反应,混匀,静置15min,510nm比色（大比色杯）AKP纯化程度鉴定AKP纯化程度用酶的比活性反映。酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。管号空白标准ABCD酶液体0.10.10.10.1蛋白标准液0.1Tris-Mg(AC)20.1BCA试剂1.51.51.51.51.51.51.取试管6支编号（体积单位为ml）2.混匀后37℃水浴30min,562nm比色（小比色杯）管号空白标准ABCD酶液体0.10.10.10.1酚标准液0.1Tris-Mg(AC)20.1复合底物3.03.03.03.03.03.0管号空白标准ABCD酶液体0.10.10.10.1蛋白标准液0.1Tris-Mg(AC)20.1BCA试剂1.51.51.51.51.51.51.取试管6支编号（体积单位为ml）酶活性测定2.取试管6支编号（体积单位为ml）酶蛋白含量测定管号空白标准ABCD酶液体0.10.10.10.1酚标准液0.1Tris-Mg(AC)20.1复合底物3.03.03.03.03.03.01.取试管6支编号（体积单位为ml）2.加入底物后,立即混匀,37℃准确15min后加入0.5%铁氰化钾2.0ml终止反应,混匀,静置15min,510nm比色（大比色杯）分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。分光光度计内放有硅胶干燥袋，需定期更换。开机预热15分钟，待仪器稳定以后再开始进行测定。每年需定期进行波长校准。必须保证测试样品为澄清的溶液，肉眼看不出来的轻微浊度也能引起读数的严重误差，必要时可通过离心来去除微粒。检测细菌培养液的光吸收时例外。从冰箱中取出的样品一定要恢复到室温后再进行检测，否则低温会使水蒸汽在比色皿表面凝结，引起读数持续漂移上升。使用分光光度计的注意事项比色杯盛液量以达到杯容积2/3左右为宜。比色杯的外表面，则必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净，然后才能把比色杯放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。不可用手拿比色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光学面