科晓仪器色谱培训班资料(二)

/科晓仪器色谱培训班资料（二）液相色谱仪维护手册科晓仪器济南分公司色谱技术服务中心地址:济南市华能路１９号446室中国（济南）留学人员创业园二期电话：2转80１传真：１网址:杭州科晓化工仪器设备有限公司济南分公司色谱仪－金牌服务专业经营：色谱仪及其它实验室设备★GＣ1690型高性能气相谱仪全国范围20０5年销量达350台★上海伍丰LC－100系列高效液相色谱仪一级经销商及售后服务点★上海精密科学仪器有限公司色谱及光谱产品华东、华中总代理及服务中心★兰化所毛细管柱及大连依利特液相色谱柱山东、河北、河南地区代理★上海海欣、上海科创、温岭福立、山东鲁南等色谱仪的经销及维修★上海雷磁、安亭、博迅、恒平、亚荣等厂家特约经销及维修点★岛津、安捷伦气液相色谱仪、普析通用光谱仪特约经销及维修点★国内外数十种实验室分析仪器销售及售后服务点★气、液相色谱仪配件及耗材供应站（批发和零售）新型的GC16９0型气相色谱仪(科晓公司生产）1690型气相色谱仪是科晓仪器公司采用国际先进技术，整合国内气相色谱仪的优点,而研发出的最新一代气相色谱,具有优异的性能和极高的性价比,标志着国产仪器已经达到一个新的水平。上海精密科学仪器有限公司分析仪器（总代理）作为国产分析行业龙头老大,以"市场导向、规范管理、品质领先、追求卓越"为企业追高目标，为市场和新老客户提供值得信赖的优异产品.上海伍丰LC-100系统高效液相色谱仪（总代理）科晓公司作为上海伍丰ＬC—1００系列S-HＰLC智能全控制液相色谱仪总代理，为了将这款优异的新型产品介绍给更多的新老客户,特举行增值派送活动回报社会!科晓仪器－－－—精诚服务联系电话：2８803４１28技术服务中心：2—８0９科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料高效液相色谱仪常规分析操作步骤及规程

ﻫ

1)。严格过滤色谱纯流动相，根据需要选择不同的滤膜。ﻫ

2）．对抽滤后的流动相进行超声脱气２0－３0分钟。

３)。打开色谱工作站,连接好流动相管道，连接检测系统。

4）.有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口,用针头抽取。冲洗进样阀，冲洗时速度不要超过1０ml/min。

５）.调节流量，初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大，压力越大，一般不要超过2000psｉ.选用合适的流速。ﻫ

6)．设定不同样品的检测器分析参数。7)．

等基线走稳即可进样分析,分析样品时对样品的前处理非常重要。8）．关机时，先关检测器,泵不要关掉,应改用流动相冲洗泵,不同的流动相冲洗时间不同，一般冲洗30miｎ，若是缓冲盐作流动相应先用水冲洗30miｎ,再用纯甲醇冲洗。

9)．然后关液相泵。

10）。需要把进样阀冲洗干净，另把注射器等工具清理整洁。ﻫ

１１）.填写登记本,由负责人签字。

注意事项：

１.首先必须是HPＬC级的,这一条相信大家都做到了。2。脱气.由于流动相里含有微量空气，经泵的压力作用，会在流通池里产生气泡，这对分析产生一定的影响，如噪音增大，甚至于掩盖信号峰。因此,流动相在使用前必须经超声脱气20分钟以上。3。过滤.由于流动相里有很微小的垃圾，如不经过过滤,偶尔会卡在单向阀门中，从而产生压力波动。这一点很多用户不太注意，等到产生压力波动又不知道什么原因产生的.科晓仪器—-－-精诚服务联系电话:288０34128技术服务中心：2—80９科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料如何选择液相色谱仪一台品质优良的液相色谱系统应从以下几个方面考虑：一．主要技术指标优异:首先是如何看指标。液相色谱仪的指标很多,有泵的、检测器的、色谱柱等等。我们认为要看主要技术指标,根据国家标准，仪器的主要指标有噪音，漂移，最小检测浓度,定性定量重复性等.这些指标都要放在系统，回路里去看，去比较。就是需要把各单元装置都要联接好，如接好色谱柱，进样阀，并且要通上流动相。因为您在分析中也都是联接好以后才可以进行分析的,而不是单单用个检测器或是泵的。然后在这个基础上，我们再去比较这些主要指标。1。噪音是指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪音越大，检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好,否则噪音过大将会导致基线不稳，甚至影响分析结果。2.最小检测浓度(最小检测限）是反映仪器灵敏度的重要参数.CL＝2×Nd×C/H(CL:最小检测浓度Nd：噪音C：样品浓度最小检测浓度H：样品峰高）由上式可见,最小检测浓度是和噪音成正比的,噪音越大，最小检测浓度就越大,灵敏度就越低.某些厂家回避了这个指标，说明他们不愿在最小检测浓度的基础上去比较噪音。3．漂移是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离，通常用来衡量仪器稳定快慢.高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定，从而在一定程度上提高了分析效率.4.定性定量重复性主要是考核仪器稳定性的指标，这对于分析样品来说是非常重要的.好的仪器其稳定性应该是十分优秀的，这就要求多次进样保留时间及含量的一致性，这样做出来的结果才能使人信服。有的朋友会认为这些指标好像都是检测器的。对的，但是就前面所说条件是要放在整个回路和系统里去看去比较。例如:泵的脉动会直接影响噪音指标，泵的流量准确度、精确度指标，以及密封性不好也会影响相关指标。所以要系统地看指标。例如：某些公司在公布的指标中,噪音和漂移指标写的条件是空池或有的干脆不写.这个指标只考核了UV检测器光学和电气的特性,与实际情况相差甚远,并没有考验泵的压力脉动，液流回路的阻尼和UV检测器流通池的性能。所以我们认为从以上的主要指标中可以反应出仪器的一些真实水平.二．操作方便:操作方便性无论是对新手还是成熟的用户都是很重要的。操作越简单,有利于提高分析效率,也为以后分析方法的拓展提供有力的帮助。上海伍丰科学仪器有限公司的WS-100工作站软件实科晓仪器-－--精诚服务联系电话:２880341２8技术服务中心：２-809科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料现了真正的智能化操作.它摒弃了以往工作站软件只能起到数据处理的理念，率先在国内推出了集控制与后处理于一身的软件，在操作使用上给用户带来了极大的方便。三.系统的，整体开发这里指的是仪器的整体开发，是一个完整的系统。目前市场上有这个现象，说我的泵是进口的，或者是检测器怎么好，用了什么很多的进口件组装等等。其实这是个误区.液相色谱是个复杂的系统,不是整体开发的,各项指标之间、软件和硬件、硬件和硬件等都不匹配，整体水平不会高到哪里去，而且在售后服务方面对用户也是不负责任的。整体开发的主要优点有:各项技术指标统一、仪器各单元的通信协调、能够建立一个整体的数字化评价系统、体现了企业的科技及开发实力.国外知名的仪器生产厂家的产品也是整体开发的,所以能够保证仪器的整体水平。四．稳定可靠,故障率低这个大家都知道，就不多说了。从以上各方面比较，伍丰仪器的LC－１０0智能液相色谱系统完全符合一台优秀仪器的所有特点，代表了目前国产液相色谱的真正水平。高效液相色谱系统中气泡对检测的影响及其解决方法在我们进行液相色谱分析时，有时会遇到这样一个问题：系统的流路中存在气泡.由于气泡的存在,会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定,使基线起伏。造成上述现象的主要原因有三条：一是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；二是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；三是在注入样品时不注意混入了空气.为了避免这类问题的出现,液相色谱实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理。常用的脱气方法有以下几种：1.吹氦脱气法使用在液体中比空气溶解度低的氦气，在０.1Mpa压力下,以约60ml/ｍin流速通入流动相１0-15ｍｉn以驱除溶解的气体。此法使用于所有的溶剂,脱气效果较好,但在国内因氦气价格较贵,本法使用较少;2。加热回流法此法的脱气效果较好；3。抽真空脱气法此时可使用微型真空泵，降压至０.０5－0．07ＭＰa即可除区溶解的气体.显然使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂体系脱气.对多元溶剂体系应预先脱气后科晓仪器--—－精诚服务联系电话：28８０3412８技术服务中心：2—809科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料再进行混合,以保证混合后的比例不变.４.超声波脱气法它是目前实验室使用最广泛的脱气方法,将配制好的流动相连同容器一起放入超声波水漕中脱气10—20ｍin即可.该方法操作简便,基本能满足日常分析的要求。5。在线真空脱气法把真空脱气装置串联到储液系统中，并结合膜过滤器,实现了流动相在进入输液泵前的连续真空脱气.此法的脱气效果明显优于上述几种方法，并适用于多元溶剂体系。其二,在液相色谱系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀,抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净。其三，在注入样品前注意排出样品注射器中的空气.液相色谱仪的最小检测浓度和流通池光程的关系与含义某些国产仪器在公布其技术指标时，大多只写了"噪音和漂移"的指标.用户觉得指标都差不多，但却忽略了另外二个较为重要的指标："最小检测浓度和光程",这二个指标有什么作用呢？它们代表了什么含义？这里来解释一下:最小检测浓度是考验仪器的灵敏度.最小检测浓度数值大，仪器的灵敏度就小，不能反应真正的噪音和漂移水平。例如:我公司的最小检测浓度小于1×1０-8g/ml（萘/甲醇溶液)，而某些仪器是:4×10-8g／ml（萘/甲醇溶液）.这就说明我们的仪器灵敏度大，可以检测更微量的样品。同样如我公司仪器把最小检测浓度调较得和其它产品是一样，也就表明我们可以做得比其它产品噪音和漂移低4倍。可以从这个公式看出:最小检测浓度=２×仪器的噪音×进样的样品浓度／样品的峰高值那光程又代表什么?我们先看下面一个公式，比尔定律：A=ｌｏg(I0/I）＝ΕclA是吸收率；I０代表参照池的光强;Ｉ为样品池的光强;ε为摩尔吸光系数；Ｃ是样品浓度;L就是流通池的光程。可以看出在同样的"C”样品浓度情况下,＂L”流通池的光程越大,仪器的＂A吸收率＂也就越大.这样可以检测到的样品浓度就越小。为什么有些厂家把仪器的流通池光程做得很小，有些只有：3．5mm、4。5ｍｍ或5．5mｍ,而不是我公司的8mm.这是因为这些厂家不能有效的降低整个系统的”噪音和漂移水平”，只能牺牲流通池光程，也就是牺牲了仪器的检测灵敏度和最小检测浓度,来达到降低＂噪音和漂移水平”目的。用通俗的说法比喻：HPLＣ就是一台音响，光程就是这台音响的音量控制键,光程越小就是把音量调小了，耳朵对音响本身的噪音和失真(可以理解为仪器的噪音和漂移)感觉就越小.但也就说明了这些仪器整体系统的制造水平不高.知道了这些道理,你在挑选液相色谱仪时别忘了这二点哦。科晓仪器—精诚服务联系电话:2８８0341２8技术服务中心：2-809科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料怎样选择色谱柱现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽,要做合适的选择,必须对此有一定的认识和了解.一。硅胶基质填料:1.正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶（Siｌica)以及其它具有极性官能团，如胺基团（ＮＨ2,ＡPＳ）和氰基团（CＮ,CＰS)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SｉOH）或其它极性基团极性较强，因此,分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如：正己烷(Hexane）、氯仿（Ｃhｌorｏform）、二氯甲烷（MetｈylｅneCｈlｏrｉde）等。２。反相色谱反相色谱用的填料常是以硅胶为基质,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物.样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有：C１8（ODS）、C8（MOＳ）、Ｃ4(Butyl）、C6Ｈ5(Phｅnｙｌ）等。二.聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等，其主要优点是在ｐH值为１～１4均可使用.相对于硅胶基质的C１8填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。三．其它无机填料其它ＨPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质,一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳正逐渐成为反相色谱柱填料.这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体,又由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何pH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在pH高达１２的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用。新型氧化锆基质色谱填料也可用于ＨPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,应用pH范围1～14，温度可达１00℃科晓仪器--－-精诚服务联系电话：2８8０3４128技术服务中心：２—８０9科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料如何保证良好的柱性能与柱寿命

认真阅读色谱柱使用说明书；

使用填充良好的色谱柱;

尽量减少压力波动，避免机械及热冲击;

使用保护柱及在线过滤器;

经常以强溶剂冲洗色谱柱;

充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分；

用稳定的固定相（C18最稳定）；

在中等ｐＨ值操作时(6～8）,用有机缓冲溶液；

色谱柱使用温度最好小于40℃

硅胶基质的的色谱柱,应保持流动相的pH值范围在3。0～８。0；

在水流动相与缓冲溶液中加200ｐpm的叠氮钠;

流动相中含有缓冲溶液，应注意用９５:5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于５％。

过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴最好）。科晓仪器－—-—精诚服务联系电话:28８034１２8技术服务中心：2—809科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料如何解决色谱柱使用过程中出现的问题一、保留值与分离度重现性不好原因分析问题原因表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子（k)，分离因子（ａ）柱效（N)保留因子（k）,分离因子（a)柱效(N)保留因子（k）,柱效(Ｎ)柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效（Ｎ）分离效果变差流动相组分改变流速改变温度改变保留因子(k），柱效变化很小保留因子(ｋ），分离因子（ａ)保留因子(ｋ),柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子(k)，柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子(k)，柱效(N）二、造成色谱峰（不对称）拖尾的原因1．色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷；2.柱头有污染;3。样品超载；4.样品溶剂不合适；5．柱外效应;科晓仪器－精诚服务联系电话：2８８０34１２８技术服务中心:2—809科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料6。化学或二次保留(硅羟基)效应；7.缓冲容量不足或不合适；8。重金属污染。三、如何解决峰形拖尾的问题Ａ.与化学有关的拖尾问题１．流动相中,加入30mM的三乙胺（用于碱性化合物）或醋酸胺（用于酸性化合物)，未知化合物加醋酸三乙胺；2。如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；3。降低进样量至＜1μg.B.与色谱柱有关的拖尾问题1．如柱头处有强保留的样品组分积聚,反相柱可用2０倍柱体积的9６％的二氯甲烷与4％甲醇，加１%氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗;2。使用保护柱。C.与ＨPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽1。进样体积过大，（通常≤25μL）;２。进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应〈20ｃm,内径为0.0０7"）;3.检测器流通池的体积过大。四、如何贮存色谱柱1。防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少,或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌生长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）;或在流动相中加20%的有机改性剂,也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气.2.尽可能将色谱柱贮存于100％有机溶剂（乙晴最好）中,避免在缓冲溶液中保存.3．使用缓冲溶液后的色谱柱，应用１5～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱,后换成10０％有机溶剂贮存。4．避免用纯水冲洗键合致密的Ｃ1８柱。5。将色谱柱的两端用堵头拧好,以免柱床填料干裂。科晓仪器———-精诚服务联系电话:２880341２8技术服务中心：2—８０9科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料如何选择保护柱

怎样选择保护柱,但又不影响分离分析？这是色谱工作者经常提出的一个问题。通常，在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。对于大部分分析工作者来说,一只1ｃm长的保护柱便能提供充分的保护作用.但是,如果样品非常不清洁,或工作中发现要经常更换１cm的保护柱，那么就应选择2cm或3cm长的保护柱.保护柱越长,自然所装填的色谱填料越多，则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会。当然，随着保护柱的长度加长,样品的保留时间会比使用短保护柱长。一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。保护柱的填料装填方式也很重要。目前有薄膜装填法的保护柱,使用过程很简单方便，而且可以在实验室中进行干装。但是，其最大的缺点是不经济,特别是针对中国的具体情况,一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料有限，只能提供很有限的保护作用；不过也因为所装填的色谱填料较少,保护柱的长度也较短,所以对分析样品的保留时间的影响也很小。另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析柱，设计方式上有直连式、手紧式或整体式。整体式设计是由色谱柱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的,必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候由色谱工作者来安装连接,可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱长度。手紧式保护柱从结构上讲是与直连式保护柱一样,只是在连接时不需要借助扳手等工具，直接用手上紧即可。另外从保护柱结构的角度看，保护柱的结构又分为是否可以更换保护柱柱芯。现在大多数的保护柱均可以更换保护柱柱芯，可以降低保护柱的使用成本。大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料，正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料.但是，根据实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料完全相匹配。对于选择保护柱的原则是:在满足分析分离要求的前提条件下,尽可能地选择较短的保护柱结构，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。科晓仪器－-－－精诚服务联系电话:288０３4128技术服务中心:2－80９科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料液相色谱柱使用注意事项色谱柱在使用前,最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考.但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。１、样品的前处理:a、最好使用流动相溶解样品。b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用0.45μｍ的过滤膜过滤除去微粒杂质.2、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中）。ｂ、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应（特殊情况除外)。c、流动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）.d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。ｅ、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡,导致实验无法进行。f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。3、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4。6ｍm的色谱柱,流速一般选择１ml／miｎ，对于内径为4。0mｍ柱,流速0.8ml/min为佳。当选用最佳流速时,分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。注意：a．由于甲醇廉价,对于反相柱推荐使用甲醇体系（必须使用乙腈的场合除外)。b．对于正相柱推荐使用沸程为3０—60ｃ。含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。d。流动相要求使用0。4５μm滤膜过滤，除去微粒杂质。e．使用HPLＣ级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命,提高柱性能科晓仪器--－—精诚服务联系电话：288034１28技术服务中心：2-8０9科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料液相色谱仪色谱柱使用及维护每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的”补偿”,而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！－——－——一定得做！ﻫ

新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且,在以后的使用中,应时常对色谱柱进行测试。ﻫ

卡套柱的安装（不加预柱）1．将卡套架套入柱芯

2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套(见左图)ﻫ

3.将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片ﻫ

４。将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧

5。然后依同样的顺序连接好柱子的另一端ﻫ

6.连接到液相色谱仪，ＰEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手ﻫ

注意:使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来,否则会造成填料的流失.ﻫ

卡套柱的安装（加预柱)ﻫ

1．将卡套架套入柱芯ﻫ

2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图）

３．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片ﻫ

4.将"子弹头”预柱放入卡套片内ﻫ

5。将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧ﻫ

６．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端ﻫ

7．连接到液相色谱仪，ＰEＥＫ接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手

更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片(同时可以修补色谱柱）ﻫ

注意:在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前,应该将色谱柱充分用水和甲醇／乙腈冲洗,而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈,以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。

１.将修补工具中的2套入柱芯的顶端

２．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧ﻫ

3。一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网

4.用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料ﻫ

5。将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平ﻫ

6．照(左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端ﻫ

７。柱芯顶端套上２，然后参照（左图）将滤网放入ﻫ

８。压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平

ﻫ

平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉,因此在用流动相分析科晓仪器－－-－精诚服务联系电话:28８0341２8技术服务中心：２—80９科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱;如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水”过渡＂.

硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相,请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡ﻫ

如何平衡色谱柱？ﻫ

平衡过程中，将流速缓慢地提高ﻫ

用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡)

ﻫ

色谱柱的再生进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵.ﻫ

ﻫ

表1建议用来冲洗的溶剂体积

色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积

１2５—41.6ml３０ml

25０—43。2mｌ60ml

250-10—20ml40０mlﻫ

请根据下表选择您的再生方法：

极性固定相(如Ｓi,NＨ2＊，ＤIOL基色谱填料）的再生：ﻫ

正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**ﻫ

非极性固定相（如反相色谱填料RＰ－18，RP－8，CN等）的再生：ﻫ

水→乙腈→氯仿(或异丙醇)→乙腈→水ﻫ

0.０５M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱

ﻫ

注意：ﻫ

在对ＮＨ2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用０.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

＊*如果简单的有机溶剂／水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质,用0．05Ｍ稀硫酸冲洗非常有效。ﻫ

ﻫ

色谱柱的维护

1．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）

2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是２—７．5,尽量不超过该色谱柱的pH范围ﻫ

3．避免流动相组成及极性的剧烈变化ﻫ

４．流动相使用前必须经脱气和过滤处理ﻫ

5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净,并保存大乙腈中ﻫ

６。压力升高是需要更换预柱的信号科晓仪器-——-精诚服务联系电话：２88０34１２8技术服务中心:2—８09科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料液相色谱仪的保养1。ＨPLC的日常操作条件：温度：10—30℃2。泵的保养:1）使用流动相尽量要清洁；2）进液处的沙芯过滤头要经常清洗;3）流动相交换时要防止沉淀；4）避免泵内堵塞或有气泡;３.进样器的保养:每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；4。柱的保养：1)柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;2)当柱子和色谱仪联结时,阀件或管路一定要清洗干净；３)要注意流动相的脱气；4）避免使用高粘度的溶剂作为流动相；5)进样样品要提纯；6）严格控制进样量；7）每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；8)每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；9）若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；5．检测器（ＵV）的保养：1)紫外灯的保养:在分析前、柱平衡得差不多时,打开检测器;在分析完成后,马上关闭检测器。2）样品池要保养。科晓仪器-——-精诚服务联系电话：28８０341２8技术服务中心：2—８0９科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料高效液相色谱日常简易保养及维护１、流动相的抽作要求:高效液相级色谱醇，二次蒸馏水,缓冲盐一定要过滤；流动相脱气至关重要（可采用抽滤，超声波脱气等方法）2、吸滤头:特殊情况下可拆下滤头抽取以判断其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判断其是否堵塞。若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。３、单向阀：如遇到泵压不稳或流动相不能抽取,则可能是单向阀出现问题,卸下用异丙醇超声波清洗，清洗时须按其安装的方向放置在小烧杯中，切记不可与安装方向倒置超洗！4、泵头：泵头漏液或出现其它故障一般要申请维修（如漏液,或更换柱塞杆及其密封垫等)5、过滤器：当色谱峰出现异常情况时,有可能是此部件被污染，拆下用异丙醇超洗或更换过滤垫片.6、排液阀：此处不能完全密封或漏液时一般是其中的垫片污染或磨损，可卸下后取出其垫片用异丙醇超声波清洗或更换垫圈。７、手动进样器：平时应注意用二次蒸馏水和甲醇在装载状态及进样分析状态清洗；如出现漏液现象,原因极可能为转子密封垫磨损或污染,一般须申请维修或更换配件。8、流通池：在色谱峰不正常时会可能是此部件补污染。可拆卸后取出其中的垫片用异丙醇超洗(可根据说明书进行操作或申请维修）。9、工作站：出现死机可重起计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。泵压不稳１、泵头有气泡—-流动相脱气／大流量冲洗泵／用注射器抽取流动动相2、单向阀故障--清洗若上述操作仍不能解决，可用异丙醇冲洗流动（无色谱柱冲洗,由手动进样器直接进检测器)，科晓仪器－－—-精诚服务联系电话:２88034１28技术服务中心:2－８0９科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料流量为3－4mｌ/min，冲洗50分钟左右,然后重新安装色谱柱，更换流动相平衡，如此再不能解决泵压波动故障，可申请更换配件。流动相含有盐分时，做完实验后一定要进行流路冲洗；首先用水冲洗，打开排液阀用PURG键转换出原有含盐的流动相,然后关闭排液阀打开泵冲洗全部流路45分钟以上,如此更换流动相为水和甲醇混合液冲洗全部流路30分钟(此步骤一般可省去，根据实验而论)，最后更换纯甲醇冲洗全部流路４5分钟以上。泵头冲洗用备件中的针头和针管分别用蒸馏水和纯甲醇冲洗３-5mｌ。如流动相不含盐,可对机器定期进行简单的冲洗维护,根据实验多少而定。手动进样器冲洗同样用备件中的针管和专用冲洗针头对手动进样器的装载状态和进样状态分别进行冲洗3-4ml的蒸馏水,然后再冲洗3-4ml的纯甲醇。确保每次做完实验，所有流路中充满纯甲醇！色谱的保养C１８柱绝对不能进蛋白样品、血样，生物样品.要注意柱子的ＰＨ值范围,不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。长时间不用仪器，应该将柱子取上用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇）保存,因为纯水易长霉。流路堵塞问题堵塞导致压力太大,按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查，并清洗。清洗方法:①以民丙醇作溶剂冲洗②放在异丙醇中超声波清洗③用１0％稀硝酸清洗.科晓仪器—-—-精诚服务联系电话：２88034128技术服务中心:２—809科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料HＰLC六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器,它是由圆形密封垫(转子)和固定底座（定子）组成。美国Rhｅｏdyｎe公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器.工作原理:１、手柄位进样（Load）位置时,样品经微量进样针从进样孔注射进定量环,定量环充满后,多余样品从放空孔排出;２、将手柄转动至进样（Iｎjｅｃt）位置时,阀与液相流路接通,由泵输送的流动相冲洗定量环,推动样品进入液相分析柱进行分析.虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点,但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备,同时增加分析准确度.如使用得当的话,六通阀进样器一般可连续进样３万次而无需维修.以下浅谈有关六通阀进样器的使用及保养事宜（仅供参考):１、手柄处于Load和Ｉｎjeｃt之间时,由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途.在ＨＰLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱,是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好,不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。2、六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时,进样量最多为定量环体积的75%,如20ｇL的定量环最多进样15p，L的样品,并且要求每次进样体积准确、相同;使用完全装液法进样时,进样量最少为定量环体积的3至５倍,即20ｇＬ的定量环最少进样60至１001aL的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用1００ul的平头进样针配合２0ul满环进样。3、可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积,譬如,一根名义上１０gL的定量环,实际是９ｇL还是１lgL并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。４、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0．４5～tm的滤膜过滤.防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损.为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inｊect位置反复冲洗,再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。科晓仪器－－－-精诚服务联系电话:288034128技术服务中心：2－809科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料高效液相色谱常见故障的断定及解决（一)保留时间变化１．柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱2．等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3．缓冲液容量不够用>25ｍmｏｌ/L的缓冲液4．柱污染每天冲洗柱5.柱内条件变化稳定进样条件，调节流动相6.柱快达到寿命采用保护柱(二）保留时间缩短１．流速增加检查泵，重新设定流速２.样品超载降低样品量3．键合相流失流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4．流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温（三)保留时间延长1.流速下降管路泄漏，更换泵密封圈,排除泵内气泡2．硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂，如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失同前(二)34。流动相组成变化同前（二)４5.温度降低同前(二）5（四)出现肩峰或分叉1.样品体积过大用流动相配样，总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱，采用较弱腐蚀性条件4。柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五）鬼峰1。进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀，改进阀和样品的清洗2。样品中未知物处理样品3。柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)４。三氟乙酸（TFＡ)氧化(肽谱）每天新配，用抗氧化剂5。水污染（反相)通过变化平衡时间检查水质量，用ＨPLC级的水科晓仪器--—－精诚服务联系电话：2８803412８技术服务中心:2-80９科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料（六)基线噪声1.气泡（尖锐峰）流动相脱气，加柱后背压2．污染(随机噪声）清洗柱，净化样品,用HPLC级试剂3。检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声)采用稳压电源,检查干扰的来源（如水浴等）5.检测器中有气泡流动相脱气，加柱后背压(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量，增加柱直径采用较高容量的固定相２。峰干扰清洁样品，调整流动相3。硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PＨ值，钝化样品４。死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整，尽可能采用细内径的连接管５。柱效下降用较低腐蚀条件，更换柱,采用保护柱（八)峰展宽1．进样体积过大同（四）１2.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散３．数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温，采用低粘度流动相6。检测池体积过大用小体积池，卸下热交换器７。保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8．柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9。样品过载进小浓度小体积样品科晓仪器－-——精诚服务联系电话:2880３4128技术服务中心:2-80９科晓化工仪器有限公司色谱技术培训资料高效液相色谱仪的几个使用问题

1。色谱柱中的流动相会排干吗？

不少做色谱分离试验的人遇