丹参对多器官功能障碍综合征大鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响

丹参对多器官功能障碍综合征大鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响【关键词】 多器官功能障碍综合征；内毒素；线粒体呼吸功能；丹参［摘要］ 目的 探讨丹参对多器官功能障碍综合征大鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响。方法 采用大鼠多器官功能障碍综合征（ MODS）模型，实验动物随机分为正常对照组（ 6只）、感染性MODS组（6只）和丹参治疗组（6只），测定大鼠肝脏线粒体的磷氧比（P/O）、3态呼吸速率（V3）、4态呼吸速率（V4）、呼吸控制指数（RCI）。结果 丹参治疗组P/O、V3和RCI明显升高（P<）。结论 丹参可以通过改善线粒体的呼吸功能减轻组织损伤，在 MODS的防治中发挥重要作用。［关键词］

多器官功能障碍综合征；内毒素；线粒体呼吸功能；丹参多器官功能障碍综合征（ multipleorgandysfunctionsyndrome ，MODS）是由创伤、失血、烧伤、休克、脓毒血症、出血坏死性胰腺炎和心肺复苏后等应激源诱发的致命性临床综合征。临床上表现为 2个以上的器官功能障碍或衰竭。MODS被认为是各种危重病最常见的死亡原因。生命器官的缺血缺氧、能量代谢障碍、氧转运和氧消耗之间关系失调等在这一过程中起着重要作用， 日益引起大家的关注。大量实验证实线粒体功能紊乱参与了休克和多器官功能障碍的发生。已有动物实验证实［1］，用内毒素（LPS）早期，就出现了线粒体功能的改变。丹参具有抗氧化、抗凝、抗血栓、抗心脑缺血及调血脂的作用，对多种动物实验性心、肝、肺等组织损伤均有明显保护作用，且有抗感染、增强免疫功能等多方面药理活性。本研究旨在初步探讨丹参对多器官功能障碍综合征大鼠线粒体呼吸功能的影响。材料与方法实验动物与分组 健康Wistar大鼠（购自中国科学院医学实验动物研究所实验动物繁育场），雄性，体重200~250g，随机分组，每组6只。（1）正常对照组：尾静脉注射生理盐水/kg。（2）模型组：尾静脉注射内毒素（LPS）5mg/kg。（3）治疗组：注射LPS前3天开始每天尾静脉注射丹参10g/kg体重，每日1次。线粒体的提取 三组动物于尾静脉注射 LPS或等容生理盐水10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔内注射麻醉后，快速断头处死。在预冷的

4h后，用/L缓冲液（PBS）中分离出大鼠心脏、肝脏和肠组织。按线粒体提取试剂盒说明书进行，将各器官组织去除结缔组织剪成碎片加 10倍分离介质，匀浆得到红棕色匀浆液。 700g4℃离心10mins，留取上清，10000g4℃离心

10mins，留取棕色沉淀，即为线粒体粗制品。将蛋白溶液以

BCA法进行蛋白定量，根据定量结果稀释为

10mg/ml，分装保存于－

70℃。线粒体呼吸功能检测［

2，3］

采用

Clark

氧电极进行测定。将新鲜制备的线粒体加入到呼吸反应缓冲液内（

150mmol/L蔗糖，25mmol/LTris-HCl和10mmol/LKH2PO4，pH），使蛋白终浓度为~/ml，加入呼吸底物5mmol/L苯噻啶和5mmol/L谷氨酸，最后加入/LADP启动3态呼吸。按下式计算磷氧比（P/O）、3态呼吸速率（V3）、4态呼吸速率（V4）以及呼吸控制指数（RCI）。（1）P/O=ADP（nmol）/O（nmol）。ADP：每次反应中所加入的ADP量，O：加入ADP后线粒体氧化磷酸化所消耗的氧原子。（2）3，4态呼吸速率（V3，V4）V＝O（nmol）/Protein（mg）。O：线粒体所消耗的氧原子量；Protein：所加入的线粒体蛋白量。呼吸速率以nmolO/（min?mgPro）表示。（3）RCI＝V3/V4统计学方法 用SPSS软件进行分析，组间比较应用方差分析，两两比较应用Student-Newman-Keuls法，以P<为差异有显著性。结果由表1可见模型组的大鼠肝脏的 P/O、V3和RCI明显降低，与正常对照组比较差异有显著性（P<）。丹参治疗组P/O由模型组的升高到；V3由模型组的（±）nmolO/（min?mgpro）升高到（±）nmolO/（min?mgPro），而V4变化不明显；呼吸控制指数由±升高为±。丹参治疗组各项指标与模型组比较差异有显著性P<）。表1丹参对多器官功能障碍综合征大鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响（略）注：与正常对照组比较，*P<；与模型组比较，**P<3讨论线粒体是细胞有氧氧化的主要细胞器，良好的血供、组织内气体弥散和交换无异常以及线粒体O2利用无障碍是维持其正常生理功能的前提。当多脏器功能衰竭时，组织缺血缺氧，当氧供进一步减少、增加氧摄取也难以满足细胞氧耗时，则发生病理性氧供依赖性耗氧，同时乏氧代谢加强，乳酸堆积而致细胞酸中毒，最终使线粒体呼吸功能损害，细胞氧摄取率下降［4，5］。能量代谢的微观机制表现为线粒体结构的异常和功能的显著下降［6~10］：线粒体蛋白含量下降；4态呼吸率升高，呼吸控制比下降合成ATP能力降低导致肝细胞能荷下降;电子传递链活性下降。Huang等对烧伤狗MODS实验模型的研究证实，MODS时，肝肾线粒体功能严重受损，线粒体和ATP亲和力下降，氧化磷酸化脱耦联，ATP减少。丹参为唇型科鼠尾属植物丹参（ Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根，又名紫丹参，是中医最常用的活血化瘀中药之一。 丹参能改善器官微循环，增加血流量，减少血小板聚集，减少血栓形成，提高组织携氧能力并能清除自由基和超氧离子，对组织细胞具有保护作用。丹参能增强实验动物的体液和细胞免疫功能，并具有一定的抗菌、抗炎、抗过敏、抗氧化、对抗内毒素的损伤以及促进组织愈合、改善心肾功能等作用，这些都为丹参防治肠道黏膜屏障损伤、 肠道及组织细菌和毒素移位，防治MODS、多系统器官功能衰竭（MSOF）提供了依据［11~13］。Skulachev将线粒体呼吸分为5种状态，评价线粒体呼吸功能更多地注重于呼吸态V3和V4，由此可以计算出RCR，RCR是指ADP控制下的氧消耗速率与不受ADP控制的氧消耗速率的比值，它是反映线粒体结构完整性及氧化磷酸化偶联程度的灵敏指标,它的下降表示线粒体氧化磷酸化能量生成偶联松弛，是代表线粒体呼吸功能较好的指标。磷氧比（P/O）指当一对电子通过呼吸链传至氧所产生的ATP分子数，它反映了线粒体利用氧化释放的能量来合成ATP的效率，是衡量氧化磷酸化效率的指标。本实验结果表明丹参可以显著提高多器官功能障碍综合征大鼠肝脏线粒体的呼吸功能。实验模型组的 3态呼吸明显下降，这是由于MODS时组织受损缺血缺氧，电子无法传递给其最终受体氧分子，造成3态效能降低，而4态变化不明显。丹参治疗组3态呼吸速率升高，呼吸控制率升高，表明线粒体呼吸功能得到改善。同时丹参治疗组P/O比值升高，ADP对线粒体的呼吸控制增加，提高了线粒体氧化磷酸化效率。本实验结果表明，丹参可以通过提高线粒体的呼吸功能，减轻MODS各脏器的组织损伤，从而在MODS的防治中发挥重要作用。［参考文献］McGivneyA,BradleySofbacterialendotoxinandlipidAonmitochondrialenzymeactivitiesofcellsincultureandsubcellularImmun，1979,25（2）:664-671.SciamannaMA,Leereperfusion-inducedinjuryofforebrainmitochondriaandprotectionbyBiochemBiophys，1993,305:215-224.DuG,Mouithys-MickaladA,SluesofsuperoxideanionbymitochondriaandimpairmentoftheirfunctionsduringanoxiaanddeoxygenationinRadicBiolMed，1998，25（9）:1066-1074.VelascoN,HernandezG,WainsteinC,etofpolymericenteralnutritionsupplementedwithdifferentdosesofglutamineongutpermeabilityincriticallyill,20XX,17（12）:907-911.姜小国，胡森.线粒体功能障碍与脓毒性休克及其预后有关.中国危重病急救医学,20XX，14（10）：624.PerseghinG,MazzaferroV,BenediniS,PulvirentiA,CoppaJ,RegaliaE,Luzienergyexpenditureindiabeticandnondiabeticpatientswithlivercirrhosis:relationwithinsulinsensitivityandeffectoflivertransplantationandimmunosuppressiveJClinNutr，20XX,76:541-548.PoonRT,Fanimplicationsofalteredenergymetabolisminpatientswith,20XX,18:283-284ChengXD,JiangXC,LiuYB,etofischemicpreconditioningonP-selectinexpressioninhepatocytesofratswithcirrhoticischemia-reperfusion JGastroenterol,20XX,9:2289-2292.FroomesPR,GhabrialH,MorganDJ,eteffectofoxygensupplementationonthearterialketonebodyratioinhuman,20XX,66:257-261.SpahrL,NegroF,LeandroG,MarinescuO,GoodmanKJ,Rubbia-BrandtL,JordanM,Hadenguehepaticmitochondrialoxidationusingthe13C-methioninebreathtestinpatientswithmacrovesicularsteatosisandpatientswithSciMonit,20XX,9:6-