临床免疫学检验技术第4节 单克隆抗体的制备及应用

医学技术学院免疫教研室第四节

单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术

1多克隆抗血清多价抗原单克隆（致敏的B细胞）单克隆抗体2

一个抗原决定簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗体称为多克隆抗体.如免疫血清。多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）3GeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibody

4单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)

由B细胞克隆产生出针对单一抗原决定簇、结构相同、功能均一的抗体。5抗体技术的发展经历了三个阶段第一代：多克隆抗血清第二代：杂交瘤单克隆抗体第三代：基因工程抗体6第一部分杂交瘤技术的基本原理7B淋巴细胞杂交瘤技术小鼠骨髓瘤细胞

免疫脾细胞（致敏的B淋巴细胞）杂交瘤8B淋巴细胞:寿命短,分泌特异性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，分泌单克隆抗体9一、杂交瘤技术10（一）小鼠骨髓瘤细胞理想骨髓瘤细胞具备的特点：

1、细胞株稳定，易于传代培养

2、自身不分泌免疫球蛋白或细胞因子

3、是HGPRT缺陷株

4、能与B细胞融合成稳定的杂交瘤细胞

5、融合率高11（二）免疫脾细胞

动物：BALB/c小鼠7-12周龄20g-25g体重雌雄均可12免疫小鼠免疫途径：腹腔内或皮内多点注射法细胞性抗原；可溶性抗原，完全弗氏佐剂+100微克抗原，3-6周100-200微克抗原，融合前3天，加强免疫。13淋巴细胞14淋巴细胞发育15浆细胞16抗原接种17（三）细胞融合培养液：RPM1640培养液DMEM培养液18

细胞融合剂PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂。培养骨髓瘤细胞选择对数生长期的细胞进行传代培养19融合方法骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)50%PEG1min内加完;2min内加10ml培养液20（四）杂交瘤细胞的选择性培养

HGPRT酶与TK酶：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶应用液：

8-氮鸟嘌呤聚乙二醇21细胞融合的选择培养基中有三种关键成分:

次黄嘌呤H、甲氨蝶呤A、HAT培养基胸腺嘧啶核苷T22HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5-7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5-7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻23骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞SP2/O:HGPRT-，TK-;长命脾细胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)杂交瘤细胞:HGPRT+，TK+;长命24

杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力2526

有限稀释法(limitingdilution)

显微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法(softagarmethod)二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存27有限稀释法特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5-1个细胞28（一）有限稀释法（二）荧光激活细胞分选仪（三）显微操作法（四）软琼脂平板法

29FACS效率最高价格昂贵30杂交瘤细胞的冻存与复苏“慢冻”：分步冷冻，

30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃-40℃

水浴中，使其迅速融化、复苏31细胞冷冻的意义防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡32第二部分单克隆抗体的制备技术33一、单克隆抗体的产生动物体内诱生方法：

BALB/c或F1代小鼠（5-10×105/只)体外培养法：中空纤维培养系统

单抗含量不高，牛血清Ab难以去除34腹腔注射法35二、单克隆抗体的纯化

半饱和/饱和硫酸铵沉淀亲和层析法纯化36McAb的纯化盐析沉淀亲和层析离子交换层析37三、单克隆抗体性质鉴定Ig类型、亚类测定特异性测定效价测定表位测定亲和力测定杂交瘤细胞染色体McAb靶抗原分子量38骨髓瘤细胞致敏的B淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体的产生39四、单克隆抗体的特性（一）单克隆抗体的特性高度特异性高度的均一性和可重复性弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性40优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。（二）单克隆抗体的优点与局限性局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体41

McAbPcAb

抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低稳定低高沉淀反应无有成本高低McAb与PcAb的比较42McAbandPcAb43第三部分基因工程抗体技术基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)

根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。44

将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体。一、人源化抗体45（一）嵌合抗体表达人-鼠嵌合抗体。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性（二）改型抗体意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗46嵌合抗体47Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段SdAb：单区抗体

二、小分子抗体48小分子抗体49三、抗体融合蛋白四、双特异性抗体五、胞内抗体六、噬菌体抗体库技术50噬菌体抗体库51单克隆抗体的应用小分子抗体的应用抗体融合蛋白的应用双特异抗体的应用抗体库技术的应