第十二章的生物合成详解

第十二章的生物合成详解演示文稿当前1页，总共64页。优选第十二章的生物合成当前2页，总共64页。在后代的个体发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA，并指导蛋白质合成，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。遗传信息的传递方向，是从DNA到RNA再到蛋白质，即所谓的生物学“中心法则”。当前3页，总共64页。某些致癌RNA病毒的遗传信息也可存在于RNA分子中，由RNA通过逆转录的方式将遗传信息传递给DNA。本章的内容涉及DNA生物合成的三个方面，第一，DNA复制，第二，RNA反转录为DNA，第三，细胞内DNA受到损伤时进行的修复作用。当前4页，总共64页。第一节DNA的复制DNA作为遗传物质的基本特点就是在细胞分裂前进行准确地自我复制，使DNA的量成倍增加，这是细胞分裂的物质基础。DNA双螺旋结构模型指出，DNA是由二条互补的脱氧核苷酸链组成，所以DNA的复制是由原来存在的分子为模板来合成新的链。即半保留复制。当前5页，总共64页。双螺旋DNA的复制当前6页，总共64页。当前7页，总共64页。一、DNA复制的方式及一般过程(一)DNA的半保留复制Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。当前8页，总共64页。1958年Meselson和Stahl利用15N在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制，他们将大肠杆菌放在含有15N标记的NH4Cl培养基中繁殖了15代，使所有的大肠杆菌DNA被15N所标记。然后将细菌转移到含有14N标记的NH4Cl培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯密度梯度离心并观察DNA所处的位置。由于15N标记DNA的密度比普通DNA(14N－DNA)的密度大，密度梯度离心时，两种密度不同的DNA在试管中分布于不同的区带。当前9页，总共64页。DNA的半保留复制第一代分子含有一条亲代的链(用黑色素示)，与另一条新合成的链(用白色表示)配对。在以后的连续复制过程中，原来亲代的两条链仍然保持完整，因此总有两个分子各具有一条原来亲代的链。

Stahl实验密度梯度离心后的DNA位置：左三管为对照；右三管为实验结果当前10页，总共64页。(二)DNA复制的一般过程：

DNA双螺旋是由两条方向相反的单链组成，复制开始时，双链打开，形成一个复制叉（从打开的起点向一个方向形成)，或一个复制泡(从打开的起点向两个方向形成)。两条单链分别做模板。各自合成一条新的DNA链。由于DNA一条链的走向是5′→3′方向，另一条链的走向是3′→5′方向，但生物体内DNA聚合酶只能催化DNA从5′→3′的方向合成。那么，两条方向不同的链怎样才能做模板呢?这个问题由日本学者岗崎先生解决。当前11页，总共64页。在以3′→5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′→3′方向的前导链，前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，因此前导链的合成是连续进行的；另一条母链DNA是5′→3′方向，它作为模板时，复制合成许多条5′→3′方向的短链，叫做随后链，随后链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。随后链只能先以片段的形式合成，这些片段就叫做岗崎片段。当前12页，总共64页。原核生物岗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般100～00核苷酸。最后再将多个岗崎片段连接成一条完整的链。由于前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制当前13页，总共64页。当前14页，总共64页。当前15页，总共64页。DNA复制的全部过程可以分成三个阶段：第一个阶段为DNA复制的起始阶段，包括起始点，复制方向以及引发体的形成；第二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随后链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段；第三阶段为DNA复制的终止阶段。在DNA复制的整个过程中需要30多种酶及蛋白质分子参加。当前16页，总共64页。二、DNA复制的起始阶段(一)DNA复制的起始点实验证明：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，该部位叫做复制起始点常用ori或o表示。DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元。当前17页，总共64页。在原核细胞中，每个DNA分子只有一个复制起始点，因而只有一个复制子，而在真核生物中，DNA的复制是从许多起始点同时开始的，所以每个DNA分子上有许多个复制子。DNA复制起始点有结构上的特殊性，例如：大肠杆菌染色体DNA复制起始点Oric由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构，其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白(解链蛋白)识别的位置。当前18页，总共64页。

大肠杆菌染色体DNA是环状双链DNA，它的复制是典型的“θ”型复制(由于形状像希腊字母θ)。从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制方向相遇时，复制就停止。而有些生物的DNA复制起始区是一段富含A·T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。当前19页，总共64页。(二)DNA复制的方向：(1)定点开始双向复制：这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式，从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链，形成一个复制泡，用电子显微镜可以观察到复制泡的存在。当前20页，总共64页。当前21页，总共64页。复制泡生长的电镜图谱当前22页，总共64页。

(2)定点开始单向复制：质粒colE1是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。当前23页，总共64页。(3)两点开始单向复制：腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。当前24页，总共64页。DNA链生长方向的三种机制当前25页，总共64页。

(三)DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质：1.解链酶DNA开始复制时首先在起始点处解开双链，反应是在一种解链酶的催化下进行的。解链酶需要ATP分解供给能量。大肠杆菌中DnaB蛋白就有解链酶活性，与随后链的模板DNA结合，沿5′→3′方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3′→5′方向移动。解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。

当前26页，总共64页。2.单链结合蛋白(SSBP)它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用。当前27页，总共64页。大肠杆菌DNA复制叉中复制过程简图

当前28页，总共64页。3.引发体的形成DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随后链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随后链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由DnaB.DnaC和单链结合蛋白组成。

当前29页，总共64页。(1)引物酶特殊的RNA聚合酶，催化短片段RNA的合成。这种短RNA一般由十几个至数十个核苷酸组成，在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3’－ＯＨ末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。(2)引发体高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体。引发体主要在DNA随后链上形成，连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物。当前30页，总共64页。

三、DNA复制的延长以及参与的酶和蛋白质分子DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将游离的四种脱氧单核苷酸(简写为dNTP)聚合成DNA的过程。这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与，现分别叙述它们在DNA复制中作用。

当前31页，总共64页。(一)DNA的聚合反应和DNA聚合酶DNA聚合酶的作用

当前32页，总共64页。1957年，Arthurkornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ，(DNapolymeraseⅠ,简写DNApolⅠ)后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ(DNapolymeraseⅡ，Ⅲ，简写DNApolⅡ,DNApolⅢ)。实验证明大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNapolⅢ起作用，而DNApolⅠ和DNApolⅡ在DNA错配的校正和修复中起作用。当前33页，总共64页。聚合酶的共同性质是：①需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶。②需要RNA或DNA做为引物，即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。③催化dNTP加到引物的3’-OH末端，因而DNA合成的方向是5′→3′。④三种DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点，所以我们着重介绍DNapolⅠ的作用并指出另外二种DNApol的特殊性：当前34页，总共64页。

1.DNA聚合酶Ⅰ：DNApolⅠ是由一条多肽链组成，分子量为109KD。酶分子中含有一个Zn2+，是聚合活性必须的。大肠杆菌每个细胞中约有400个酶分子，每个酶分子每分钟在37℃下能催化667个核苷酸参入到DNA链中，用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水介成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为klenow片段，小片段为34KD。大小片段具有不同的酶活性。当前35页，总共64页。1956年由ArthurKornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。

当前36页，总共64页。DNAPolⅠ在空间上近似球体，直径约65A。在酶的纵轴上有一个约20A的深沟，带有正电荷，这是该酶的活性中心位置，在此位置上至少有6个结合位点:模板DNA结合位点;DNA生长链或引物结合位点;引物末端结合位点，用以专一引物或DNA生长链的3'-OH;脱氧核苷三磷酸结合位点;5'→3'外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5'-端脱氧核苷酸并切除之;3'→5'外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的3'-端核苷酸。当前37页，总共64页。

(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合酶活性：这是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸顺序，将互补的dNTP逐个加到引物RNA3’-OH末端，并促进3’-OH与dNTP的5’-OH形成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对才有催化作用，5′→3′聚合酶活性存在于klenow片段上。当前38页，总共64页。当前39页，总共64页。当前40页，总共64页。(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性：这种酶活性的主要功能是从3′→5′方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的。当前41页，总共64页。当前42页，总共64页。(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性：这种酶活性是从DNA链的5’-端向3’-末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除10个核苷酸。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用，对完成的DNA片段去除5’-端的RNA引物也是必须的。当前43页，总共64页。当前44页，总共64页。

DNApolⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性协同作用，可以使DNA一条链上的切口从5′→3′方向移动，这种反应叫做缺刻平移，利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷(α-32PdNTP)的标记制成探针(probe)，进行核酸的分子杂交实验，是现代分子生物学的一项重要技术。当前45页，总共64页。缺刻平移标记DNA探针许多实验证实DNApolⅠ并不是DNA复制过程中的主要酶，它的作用主要与DNA损伤后的修复有关。当前46页，总共64页。

2.DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)此酶分子量为120KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有DNapolⅠ的5%，它具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，而没有5′→3′外切酶活性，它的作用可能与DNA损伤修复有关。当前47页，总共64页。3.DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)DNA聚合酶Ⅲ催化先导链和随后链的合成当前48页，总共64页。真核生物DNA复制叉结构示意图

当前49页，总共64页。该酶在DNA复制过程中起主要作用，是一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞600kDa，酶分子形成一个不对称的二聚体。每个大肠杆菌细胞中只有10?0个酶分子，但催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的，约为9000核苷酸/酶.min。在染色体DNA进行复制时，DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的，而是与引发体，解链酶等构成一个复制体。由于复制体的存在，先导链和随后链可以同时复制。随后链的模板DNA在DNA聚合酶Ⅲ全酶上绕转了180°而形成一个圈，因此岗崎片段的合成方向能够与先导链的合成方向以及复制体移动方向保持一致。当前50页，总共64页。随着DNApolⅢ向前移动，先导链的合成逐渐延长的同时，岗崎片段也在不断延长，圈也在不断扩大。当岗崎片段合成到前一个片段的5’-端时，这一大圈就释放出来，由于复制叉向前移动又将另一部分随后链的模板置换出来，由引发体合成新的引物，然后再形成一个小的圈，进行新的岗崎片段的合成。由此可知：随后链的合成需要周期性的引发，因此其合成进度总是与前导链相差一个岗崎片段的长度。当前51页，总共64页。岗崎片段完成后，其5’-端的RNA引物由DNapolⅠ的5′→3′外切酶活性切除，由此造成的空隙再由DNApolⅠ的5′→3′聚合活性催化dNTP得到填补。所以DNA的复制是在DNapolⅢ和DNApolⅠ互相配合下完成的。当前52页，总共64页。

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ分子量109KD120KD＞600KD每个细胞中的分子数40017-10010-205′→3′聚合活性+++37℃转化率核苷酸数／酶分子·分钟6003030,0005′→3′外切活性+--5′→3′外切活性+++切刻平移活性+--对dNTP亲和力低低高功能修复不详复制去除引物

填补空缺

真核生物DNA聚合酶特点当前53页，总共64页。真核细胞在DNA复制中起主要作用的是DNApolα，主要负责染色体DNA的复制。DNapolβ的模板特异性是具有缺口的DNA分子，被认为它与DNA修复有关。DNapolγ在线粒体DNA的复制中起作用。DNApolδ不但有5′→3′聚合活性，而且还具有3′→5′外切酶活性，据认为真核生物DNA复制是在DNapolα和DNApolδ协同作用下进行的，前导链的合成靠DNApolδ催化，并且还需要一种细胞周期调节因子(PCNA)参与。而随后链的合成靠DNApolα和引发酶配合作用完成。当前54页，总共64页。(二)与超螺旋松驰有关的酶：DNA复制从起始点开始向一个方向复制时，局部的DNA双链必须打开，主要靠解链酶的作用，打开后的单链还需要单链结合蛋白与其结合，在复制叉向前移动时造成其前方DNA分子所产生的正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决。下面分别介绍它们的作用。当前55页，总共64页。拓扑异构酶是一类改变DNA拓扑性质的酶。在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应，而在生物体内它们参与DNA的复制与转录。在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。DNA复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，使DNA缠绕、折叠，压缩以形成染色质。DNA拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它们广泛存在于原核生物及真核生物中。当前56页，总共64页。大肠杆菌和真核生物中的拓扑异构酶类型作用对超螺旋的作用Ⅰ型拓扑异构酶

大肠杆菌切开一股DNA链松驰负超螺旋真核生物切开一股DNA链松驰正，负超螺旋Ⅱ型拓扑异构酶

大肠杆菌切开二股DNA链构驰正超螺旋；依赖ATP引入负超螺旋，

解环连等真核生物切开二股DNA链松驰正超旋，依赖ATP但不能引入负超螺旋当前57页，总共64页。拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用是将环状双链DNA的一条链切开一个口，切口处链的末端绕螺旋轴按照松驰超螺旋的方向转动，然后再将切口封起来。这就使DNA复制叉移动时所引起的前方DNA正超螺旋得到缓解，利于DNA复制叉继续向前打开。拓扑异构酶Ⅰ除上述