分离科学第六章 色谱法

分离科学第六章色谱法第一页，共一百九十三页，2022年，8月28日色谱学基本概念和术语：

色谱的流出曲线基线色谱峰峰高区域宽度峰面积保留值相对保留值柱效分离度第六章色谱法第二页，共一百九十三页，2022年，8月28日两个基本特点：

(1)不同组分分子差速迁移

热力学

(2)同种组分分子分布离散

动力学第六章色谱法第三页，共一百九十三页，2022年，8月28日色谱过程热力学基础两相分配差异造成差速迁移

自发过程----自由能减少

判断依据----化学势(偏摩尔自由能)

平衡状态----化学势相等第六章色谱法第四页，共一百九十三页，2022年，8月28日色谱体系中溶质量很小，一般做稀溶液处理：第六章色谱法第五页，共一百九十三页，2022年，8月28日分配系数K（1-5）

（1-6）

相互作用力差别（焓变）自由度的变化（熵变）官能基团分子大小和空间排列第六章色谱法第六页，共一百九十三页，2022年，8月28日影响分配系数的因素:

(1)溶质

(2)固定相

(3)流动相

(4)温度

T一定、K为常数?分配等温线第六章色谱法第七页，共一百九十三页，2022年，8月28日三种分配等温线及其相应色谱峰形第六章色谱法第八页，共一百九十三页，2022年，8月28日色谱过程动力学理论基础色谱流出曲线的形状色谱区域宽度扩张峰形拖尾高效能色谱柱系统峰形预测重叠峰定量解析选择最佳分离方法解释实现第六章色谱法第九页，共一百九十三页，2022年，8月28日图1.4四种色谱类型的流出曲线（1）线性理想色谱。溶质的迁移决定于分配系数，迁移过程中谱带形状不变（2）非线性理想色谱。谱带不对称，呈鲜明的前升或者拖尾第六章色谱法第十页，共一百九十三页，2022年，8月28日图1.4四种色谱类型的流出曲线（3）线性非理想色谱。存在分子扩散和传质阻力等，溶质通过色谱柱后谱带对称展宽，呈Gaussian曲线。大部分色谱过程属于这种类型第六章色谱法（4）非线性非理想色谱。数学处理非常复杂，做适当假设和简化后可以部分说明实验数据。第十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日色谱动力学理论发展：根据溶质迁移过程及各种影响因素，列出偏微分方程组，求出描述色谱谱带运动的方程式。

平衡色谱理论（1940年Wilson）塔板理论（1941年，Martin和Synge）速率理论（50年代，vanDeemter等）第六章色谱法第十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日平衡色谱理论基本假设：不考虑传质速率的有限性和物质的扩散对平衡过程的影响。dxc+dcc(c+dc)puqdt=pqdxcpuqdtMobilephaseStationaryphaseq=(1-p)qdx第六章色谱法第十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日

色谱柱内某一小段dx处，其柱截面积为q，p为柱管横截面上流动相占的分数。则进入dx内的物质量为cpuqdt。由于固定相对组分的吸收，流动相中组分的浓度变为c+dc。自小段dx出来的物质量为puq(c+dc)dt。小段在相应时间内物质的变化量为同理，小段固定相内物质的变化量为第六章色谱法第十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日

进入dx小段内流动相中组分的量和从小段中出来的组分量之差，等于小段内（包括流动相和固定相两部分）相应时间内该组分变化的总量，即：第六章色谱法第十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日设物质在两相间的分配方程为：第六章色谱法第十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日可以得到区域中心移动速度的关系式：保留时间等于柱长除以谱带移动速度，即第六章色谱法第十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日k’定义为容量因子为流动相所占体积与固定相所占体积之比，称为相比。局限性在于没能解释色谱峰展宽的现象。第六章色谱法第十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日塔板理论（1）平衡能够在一个小段色谱柱（理论塔板）内形成，相应的色谱柱长称为理论塔板高度（H）。K为分配系数。（2）H为常数，色谱柱内塔板数目为n=L/H。（3）流动相不可以被压缩。（4）塔板编号依次为0，1，2，3，n，总塔板数为n+1，实际上n很大，所以总塔板数约等于n。第六章色谱法第十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日（5）假定流动相不是采取连续的方式前进，而是跳跃式前进。设q和p分别是柱的横截面积和在柱横截面积中流动相所占据的截面积分数，那么一个塔板上流动相所占据的空间体积为Hqp。当通过色谱柱的流动相体积为V时，相当于流动相在整个柱内每个塔板上跳动的次数为r=V/Hqp。（6）全部样品开始都集中在第一块塔板上。（7）分配系数不随组分浓度变化，即分配等温线是线性的。第六章色谱法第二十页，共一百九十三页，2022年，8月28日基本关系式

在塔板上，某一个分子出现在流动相中的概率Pm：第六章色谱法第二十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日经过r次跳跃后，各塔板上溶质的分布可以用二项展开式来描述。根据上面的式子可知，经过r次跳跃后在第n块塔板上出现的概率P(r,n)（rn）为：第六章色谱法第二十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日如果进样量为m，那么第n号塔板上物质出现的量为：

塔板理论的保留值（1-27）

第六章色谱法第二十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日第六章色谱法第二十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日塔板理论的色谱流出曲线方程当二项式分布的n，r很大时，可以用正态分布函数来表示：所以

第六章色谱法第二十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日r足够大时，进入检测器的溶质浓度为：第六章色谱法第二十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日当V=VR时，流出浓度最大：

影响色谱峰高的因素有：(1)进样量m----进样量和色谱峰高成正比；(2)塔板高度H----H小，柱效率高，Cmax/m大；(3)色谱柱越细，q越小，填充越紧密，p越小，Cmax/m越大。在其他参数不变时，Cmax正比于m/q，因此单位体积柱管进样量大小是衡量柱管负载的指标；(4)色谱柱越短（L越小），Cmax/m越大；(5)k’大的组分Cmax/m小（假定H对所以组分相同）。第六章色谱法第二十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日色谱峰区域宽度与溶质的保留值成正比。死体积与色谱柱的结构有关，色谱柱内径大，填充疏松，死体积大，色谱峰区域宽度大。色谱峰区域宽度与柱长的平方根成正比。色谱峰区域宽度与塔板高度的平方根成正比，即色谱柱柱效越高，H越小，色谱峰区域宽度越小。第六章色谱法第二十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日（1）不能解释不同流动相流速下同一溶质将给出不同的理论塔板数。（2）没有阐明理论塔板数和塔板高度的色谱含义和实质。（3）没有深入讨论影响塔板高度的因素，因而对色谱体系的设计、色谱操作条件的选择的指导意义十分有限。第六章色谱法第二十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日速率理论

运用流体分子规律研究色谱分离这种“非平衡”过程。

随机过程总是导致Gaussian分布2----溶质在色谱柱内离散的度量，与柱长成正比：第六章色谱法第三十页，共一百九十三页，2022年，8月28日

色谱过程总的色谱区带扩张等于各个独立因素引起色谱区带扩张的和，即各独立离散项具有加和性：第六章色谱法第三十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日（1）涡流扩散；（2）纵向分子扩散；（3）传质，包括流动相传质和固定相传质。第六章色谱法第三十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日填充柱气相色谱速率方程液相色谱速率方程第六章色谱法第三十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日6.2高分辨气相色谱(毛细管柱气相色谱）概述

1956年，Goly认为填充柱可以看成是一束涂有固定液的毛细管。他认为用中空的开管柱，将固定液涂渍在其内壁，从而克服路径差异。并从理论上推断，柱效达到填充柱的上百倍甚至更高。因此出现了开管柱气相色谱的概念。第六章色谱法第三十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日开管柱气相色谱速率方程

1958年，基于VanDeemter方程，Goly提出了影响开管柱色谱峰扩张的因素：第六章色谱法第三十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日与填充柱的速率方程相比：（1）开管柱只有一个气体流路，没有涡流扩散项（多径项），即A＝0。（2）分子扩散项和填充柱相似，但是没有分子扩散路径弯曲，其路径弯曲因子γ＝1。（3）传质项和填充柱相似，但是以柱内径r代替载体粒径dp，而且Cl一般比填充柱小，气相传质阻力常常是色谱峰扩张的主要因素。第六章色谱法第三十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日影响开管柱柱效的因素：（1）流动相及其线速度图1开管柱板高随流动相线速度的变化曲线第六章色谱法第三十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日和填充柱相似，同样有最小板高和最佳流速，分别为：（8）（9）第六章色谱法第三十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日

当u>uopt时，因为开管柱液膜厚度小，液相传质阻力小，开管柱的板高随流速的上升斜率小于填充柱。比填充柱更适合于快速分析。填充柱和开管柱板高随流动相线速度的变化曲线第六章色谱法第三十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日（2）柱内径

最小板高和柱内径成正比，因此应该尽可能使用小内径的柱子。实际应用中一般大于0.25mm，因为太细的柱子固定液涂渍操作不便，柱子渗透性差，柱容量低。柱内径选择要兼顾柱效和分析速度以及柱容量。第六章色谱法第四十页，共一百九十三页，2022年，8月28日（3）液膜厚度液膜厚度dl是开管柱的重要参数。液相传质阻力系数和dl2成正比。因此降低液膜厚度是提高柱效的重要方法。但是dl降低，柱容量降低，对进样和检测系统提出了更高的要求。液膜厚度过大，稳定性下降，因此要兼顾柱效、柱容量和稳定性来选择液膜厚度。一般WCOT柱dl在0.1~1m之间，SCOT柱dl在0.8~2m之间，填充柱dl达10m。第六章色谱法第四十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日（4）相比

同一种固定液开管柱的相比要比填充柱大得多，因此要达到相同的分离度，所需要的理论塔板数要大得多。同理，当柱子内径增加时，相比也增大，因此要得到相同的分离度，柱子长度也要相应增加。第六章色谱法第四十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日3开管柱的制备（1）柱材料（a）表面惰性化，不参与保留或吸附被分离组分；（b）表面改性以确保固定液能够均匀涂渍。第六章色谱法第四十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日金属材料：铜、镍、不锈钢等，早期应用，价格贵，表面活性大，高温下催化样品塑料：早期应用，不耐高温玻璃：表面性质优于金属材料，实验室易于拉制，价格便宜，70年代后应用较多石英：性能最好，应用最多，商品化，80年代开始取代玻璃称为主要材料第六章色谱法第四十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日（2）开管柱的表面特性超纯石英的融凝硅石（99.9999%SiO2）只含有小于1ppm的硅醇基和金属氧化物，具有很好的表面惰性和稳定性，不必经过处理或者钝化就能涂渍固定液。然而一般纯度不高的石英含有180~1200ppm的硅醇基和金属氧化物杂质，涂渍前也需要进行表面处理。第六章色谱法第四十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日（3）开管柱内表面处理目的：

1）除去表面活性点，使表面能分布均匀；

2）改变表面的物理化学性质，提高表面润湿性。

3）增加表面积，提高固定液的涂渍量。第六章色谱法第四十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日

这些目标很难同时实现。当表面去活后，原来的高能表面变成低能表面，对于大多数非极性固定液的涂渍不存在问题。对于中等极性的固定液，要求表面去活而又需要保持一定的表面能，常遇到一些困难。对于高极性的固定液，趋向于形成自己的去活层或者块状活性点，不进行表面处理也可以进行涂渍。因此，对于不同极性的固定液，表面处理的方法也应该不相同。第六章色谱法第四十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日表面粗糙化处理增加表面积来提高润湿性。因为表面上界面间的作用力可以消耗液滴的内聚力，液滴下被粗糙化的表面积越大，总的作用力越大，消耗的内聚力越大，从而减少液滴在该表面上的接触角而铺展开来。另外，增大表面积还可以增大涂渍量从而增大柱容量。第六章色谱法第四十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日柱壁粗糙化方法一般采用：1）表面腐蚀：腐蚀一般用氯化氢气体（氯化钠加浓硫酸产生）以静态或者动态的方法进行，使之形成规则排列的氯化钠晶体粗糙层。静态法：柱子充满氯化氢气体，两端用微型喷灯封死，在300-400C约3~12小时。形成的颗粒均匀。动态法则让氯化氢连续不断通过柱子。

腐蚀法不适合石英毛细管柱，因为腐蚀后柱壁变薄，容易脆断。第六章色谱法第四十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日2）沉积惰性微粒。从溶液中沉积一层薄而均匀的微颗粒物质。如采用动态涂渍法将含有三氯乙烷的饱和NaCl的甲醇饱和溶液通过柱子，可以形成致密的氯化钠晶体层，去活后可涂渍极性和中等极性固定液；将二氧化硅的分散悬浮溶液通过柱子，然后挥发去溶剂可以沉积SiO2粉末涂层，经此方法涂渍的柱子可以涂渍极性较大的固定液。第六章色谱法第五十页，共一百九十三页，2022年，8月28日表面惰化处理表面粗糙化可以改善柱子的浸润性，但也使活性增大。如果不能有效去活，对于涂渍非极性和中等极性固定液的柱子将会造成严重吸附。通常硅醇基团的去活比金属杂质造成的Lewis酸点的去活要容易。第六章色谱法第五十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日1）表面羟基化－涂渍极性柱石英柱因为在高温下拉制，表面羟基很少。因此水热处理以获取丰富得表面羟基对涂渍极性柱非常重要。很多人提出用盐酸或者硝酸来处理柱子，其中20%的硝酸在200C处理，随后硅烷化处理可以得到最好的去活效果。对于玻璃柱可以用不同浓度的盐酸进行沥滤处理。第六章色谱法第五十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日2）去活（惰化）有效的去活作用取决于石英的特性、固定液和被分析样品的种类以及表面粗糙化的方法等诸多因素，没有通用的去活方法。（a）早期,在表面预涂上一层表面活性剂薄膜，利用其极性端与柱表面活性点作用使之惰化，另一非极性端朝向固定相使其表面张力下降，从而改善润湿性。缺点去活难以完全，难重复，热稳定性有限。第六章色谱法第五十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日（b）用有机化合物的高温下热解产物与硅羟基反应也能够有效地掩蔽活性点。例如经过280C热处理，聚乙二醇在表面形成非萃取的分子层。（c）更广泛的应用方法是各种硅烷化方法，它是消除表面羟基最有效的方法。硅烷化试剂主要有三甲基氯硅烷、六甲基二硅氨烷、二甲基二氯硅烷、三苯基氯硅烷等，完全硅烷化反应需要300-400C高温。第六章色谱法第五十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日（4）固定液固定液决定了对被分离物质的选择性能力，这和固定液的组成与结构有关。要求:

组成明确不含容易引起试样催化分解的活性杂质

易于涂渍热稳定性和化学稳定性好第六章色谱法第五十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日聚乙二醇（PEG，又名Carbowax）包括不同分子量的聚乙二醇，改性聚乙二醇、聚乙二醇与不同的酸反应得到的脂等，广泛应用于胆甾醇脂、脂肪酸甲脂、精油等多种极性化合物的分析。主要问题是化学稳定性差，最高使用温度低（<270C）。第六章色谱法第五十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日聚苯醚（PMPE）效果较好的高温固定液，有良好的选择性和热稳定性，早已用于精油、多环芳烃、甾醇、小肽和糖衍生物的分析。但是合成困难，因而使用不广泛。第六章色谱法第五十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日聚胺（聚酰胺和聚亚酰胺）极性极强，具有高的热稳定性和良好的润湿能力，尤其适合与毛细管柱的涂制。对各种醇类、胺类的分离特别有效，也适合药物和糖类的分析。但是对氧敏感，而且在有机溶剂中溶解度差。第六章色谱法第五十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日聚苯砜（PPES）具有聚脂类极性的超高温固定液，在400C以下有很好的热稳定性，特别适合于GC-MS。适用于胆甾体异构体、豆甾醇、谷甾醇、海洋甾醇等硅烷醚衍生物以及煤焦油中多环芳烃的分离，以及碳数相同但是饱和程度不同的甘油三酸脂。唯一缺点是熔点高，不利于低沸点组分的分析。第六章色谱法第五十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日聚硅氧烷（polysiloxane）热稳定好、成膜性好、适用温度范围宽，能够在侧链上引入不同的基团以适应各种需要等优点。新近合成的具有高温高选择性的毛细管气相色谱固定液大都以聚硅氧烷为骨架，在主链或者是侧链引入不同的分子片段，以改变极性（侧链引入氰苯基或其他极性基团）、增加热稳定性（主链引入亚苯基）、增加选择性（引入手性基团、液晶分子、冠醚、杯芳烃等分子片段）。第六章色谱法第六十页，共一百九十三页，2022年，8月28日（5）毛细管柱的制备过程

涂渍为获得高的柱效，应确保固定液呈均匀液膜完全覆盖柱子内壁表面。涂渍方法有：动态涂渍法适合：固定液黏度小、流动性好。涂渍厚度取决于涂渍液的黏度、浓度、流动速度以及溶剂的挥发速度。特点：简便、快速，应用广泛。但是重现性差，柱效比静态法低，液膜厚度难以准确预测。第六章色谱法第六十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日动态涂渍法具体操作过程：根据固定液极性不同，以二氯甲烷或者丙酮等做溶剂，配制5~30%（w/v）的固定液溶液，过滤后在高压氮气严格控制流速的情况下压入毛细管柱内，当充满约20%柱长时将毛细管从固定液中拉起，让氮气以稳定的流速推动固定液液栓流过柱子，液栓移动速度一般为1~2cm/s。为防止液栓离开柱子时柱压突然变化，柱后应该连接一根柱内径完全相同，长度约10米的毛细管做缓冲柱。涂完后继续通氮气3~4小时以完全除去溶剂。第六章色谱法第六十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日

静态涂渍法固定液溶于二氯甲烷、戊烷等易挥发溶剂，0.2~25（w/v），抽入或者压入柱子中，一端封死，另一端接真空泵，在低于溶剂沸点10~15C的恒温条件下使溶剂缓慢挥发。为了使挥发能够顺利进行，抽空前应将充满固定液溶液的柱子静置数小时使存在于柱表面微孔中的气体溶解在涂渍液中，以避免产生气泡二影响溶剂的均匀挥发。静态涂渍法的液膜厚度可以计算得到：（10）第六章色谱法第六十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日

对于表面张力大或者粘稠的固定液应采用静态涂渍法。

优点：重现性好，柱效高。但是柱端封口技术要求较高，成败关键在于溶剂与封口的截面不能流下气泡，否则将会部分或者全部将柱内的涂渍液带出柱外。

缺点：涂渍时间长（几十小时）。第六章色谱法第六十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日固定液的交联固化原位交联或者是键合来提高液膜的稳定性。原位加热缩合（1）涂布在柱子内的带有端羟基的固定液在加热过程中直接与玻璃内壁的硅羟基缩合，实现交联固化。这种方法布需要引入任何交联引发剂，可应用于各类端羟基固定液。第六章色谱法第六十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日

（2）交联剂作用下产生交联缩合固化：通常是将还有一定数量的交联剂的端羟基固定液涂渍柱子后，用氮气冲洗柱子后，封死两端，60C恒温一段时间后再装入色谱仪中升温至280C保持6小时，即可完成固化。常用的交联剂有：氰丙基二乙氧基硅烷、二甲基二乙氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷等。第六章色谱法第六十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日原位自由基引发法

自由基引发法是目前应用广泛的一种交联方法，其机理是通过不同方法产生自由基母体，按下面的方式产生Si-C-C-Si链段交联结构。第六章色谱法第六十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日产生自由基的方法主要有：（1）过氧化物和偶氮化合物引发。自由基由引发剂加热分解产生，因此应具有较低的分解温度，分解产物非极性，无活性，易除去。常用的有过氧化苯甲酰（BP）、过氧化二异丙苯（DDUP）、偶氮叔丁烷（ATB）、偶氮叔辛烷（ATO）等。固定液的性质以及链长对交联结果有很大影响。第六章色谱法第六十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日（2）臭氧引发。优点在于柱子可以先进行评价，然后选择好的再用臭氧引发交联，条件容易控制，重复性好，没有残留物。（3）高能辐射交联。在60Co的γ射线辐射下交联。优点是不引入任何杂质，结果可靠，柱子极性和活性没有变化，能用于制备厚液膜毛细管柱，缺点是一般实验室不具备60Co源，应用受限制。第六章色谱法第六十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日加成型交联法利用端基还有乙烯基的低分子量硅油或者含氢硅油在微量铂催化剂作用下室温即可在玻璃柱内完成加成型交联。简单、可靠、有效，但应用范围有待扩大。第六章色谱法第七十页，共一百九十三页，2022年，8月28日交联柱的优点：（1）粘度增大，减小固定液流失。粘度受温度影响小，增加了高温下液膜的稳定性，提高了固定液的使用温度。（2）抗溶剂冲洗，有利于毛细管柱头沉积物的清洗。（3）在有机溶剂中溶解度小，允许大体积稀溶液进样而不导致柱子超载，对痕量分析有利。（4）热重排小，可以在高温下长期使用。（5）有利于大口径厚液膜柱的制备。第六章色谱法第七十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日柱子的老化老化是整个制备柱子步骤中关键的最后一环。例如Carbowax-20M柱子在200C老化4小时每米柱效可以达到700~1000个塔板，老化16小时可以达到1500~2000个塔板，提高一倍。老化过程应该慢速升温（1~4C/min），最终老化温度应比固定液的最高使用温度低20~30C。载气必须脱水脱氧，特别是对聚脂类和聚醇类固定液。第六章色谱法第七十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日4开管柱的质量评价

（1）柱效（2）惰性（3）固定液膜的热稳定性反映了柱子的综合性能以及制备过程中对关键步骤准确重复的严谨程度。

第六章色谱法第七十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日（1）柱效塔板数，表示柱效一般有理论塔板数N、有效塔板数Neff。（11）（12）第六章色谱法第七十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日

理论塔板数和有效塔板数相差很大:

固定液涂渍不均匀、载气流速过高、进样量过大或者柱温过高等。理论塔板数多的柱子，虽然有效塔板数不一定多，但常常说明这根柱子很有潜力，只要将条件改善就可以成为有效塔板数多的柱子。而理论塔板数小的柱子，无法使其有效塔板数多起来。第六章色谱法第七十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日

不论是理论塔板数还是有效塔板数，其测定都随组分保留时间、载气流速、柱子尺寸、固定相液膜厚度等因素变化而变化。小k’的柱子总可以得到更大的塔板数。因此一般在k’>2的条件下测定，常用的物质有萘、十二烷等。第六章色谱法第七十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日（2）涂渍效率（coatingefficiency,CE）涂渍效率是在最佳条件下理论和实测的塔板高度之比，用百分数表示：（13）其中H理论即Hmin由下式计算得到：（14）第六章色谱法第七十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日

涂渍效率高，说明柱子的理论利用效率高。用它来评价柱效的优点是和柱子长度无关，而且包括了组分容量比和柱子直径等参数，可用于柱子间质量的直接比较。一般较好的柱子涂渍效率在80%~100%之间。涂渍效率计算不适用于PLOT柱和须状表面柱。

第六章色谱法第七十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日（3）惰性色谱柱的惰性好坏直接影响柱子的柱效、柱内液膜的稳定性以及对组分的有效分离和检测。活性与柱子材料、处理方法、固定相极性、柱内载体材料、液膜厚度等有关。活性主要指的是吸附活性和催化活性。其中吸附活性又可表现为可逆吸附和不可逆吸附两种。第六章色谱法第七十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日

柱子的活性会导致：（1）峰展宽；（2）峰型拖尾；（3）峰面积或者峰高减小甚至消失；（4）峰面积变化不大但是保留值显著增加。第六章色谱法第八十页，共一百九十三页，2022年，8月28日

吸附作用大致分为三种：（1）极性组分与柱子内壁硅羟基或者硅氧烷桥之间的氢健相互作用；（2）与氢健作用无关但是机理不清楚的吸附作用；（3）存在于玻璃或者载体内金属氧化物所表现出来的酸碱活性引起的吸附，这类活性点在高温时也会产生对试样催化作用。第六章色谱法第八十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日Grob提出了评价毛细管柱综合性能的标准化实验方法：浓的Grob实验混合物的组成实验缩写20mL正己烷溶剂中物质

所溶解的量（mg）甲基癸酸脂E10242甲基十一酸脂E11236甲基十二酸脂E12230癸烷C10172十一烷C11174十二烷**C12

辛醇-1ol222壬醛al2502，3-丁二醇*D(diol)3802，6-二甲苯胺A2052，6-二甲苯酚P194二环己基胺am2042-乙基己酸S242*2，3-丁二醇溶于氯仿；**代替十一烷以减少在极性固定相中峰重叠的可能性。（取各种所需物质1mL混合,稀释至200倍）第六章色谱法第八十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日辛醇-1和2，3-丁二醇用来检测第一类氢健吸附;壬醛用来检测第二类吸附;第三类吸附用AP实验来测定，即将含有AP的混合样进样，根据二者的峰高或者峰面积的比值来表征柱子的酸性、碱性或者中性。即A/P>1为碱性，A/P<1为酸性，A/P=1为中性。

如果在接近中性的柱子上，A和P的峰高都没有达到理论值的100%，但是二者的峰面积比接近1。实际上这类柱子即具有酸性也具有碱性，这种情况下无法判断这类柱子适合酸分析还是碱分析。此时应该用空间位阻大的am（二环己基胺）和S（2-乙基己酸）进行更加严格的酸碱测试。因为这一对混合物可以避免氢健型吸附对峰值的影响，所得结果只反映酸碱性吸附。

第六章色谱法第八十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日Grob方法的优点：一次实验可以同时取得反映柱子性能的多个方面内容，即分离效率、吸附活性、酸碱度以及固定液液膜厚度等因素。适用于不同类型和不同极性固定液柱子的性能评价。条件标准化所得结果可以直接进行比较。包括了某些定量概念。第六章色谱法第八十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日Grob实验方法的标准化实验条件：柱长（m）H2做载气时甲烷流出时间（s）升温速率（C/min）N2做载气时甲烷流出时间（s）升温速率（C/min）10205.0352.515303.3531.6520402.5701.2530601.671050.8440801.251400.63501001.01750.5第六章色谱法第八十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日Grob标准实验的步骤：柱温开始温度小于40C。通过甲烷的流出时间测定载气流速和合适的分流比，使仪器的死时间误差调整到表中所示的标准时间的±5％以内。按表2-2设定升温速率。进混合物样，使每个样品组分的量约为2.0ng。进样后迅速将炉温升至40C，然后开始程序升温直至达到终温。记录混合试样中各组分的峰高和相应流出时间以及流出温度。第六章色谱法第八十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日

将不被吸附的两种烷烃和三种脂肪酸脂的峰顶点相连画成一条100%的线，如图所示。柱子的活性以未达到100%连线的余下各峰的高度占基线于100%线间距离的百分数来表示。由此计算出各组分的损失量，可以定量测出不可逆吸附，也为柱子对各种样品分析的适用性提供有用信息。

吸附活性定量测试图（虚线为100%线）第六章色谱法第八十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日Grob标准实验中需注意的问题：不能用于测定高熔点固定相的柱子。对于一个新的固定相，需要标样对每个峰定性，确定流出顺序。倾向于测定吸附活性，对催化活性观察不到。一般柱子活性是温度的函数，低温时以吸附活性为住，高温时催化活性逐渐增大并成为主导。第六章色谱法第八十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日（4）热稳定性毛细管柱常采用程序升温方法和结合GC/MS等联用技术，要求固定液涂渍毛细管柱具有良好的热稳定性。影响柱子的稳定性的因素主要有两方面：一是固定液本身的热稳定性；二是柱表面对固定液的催化作用。第六章色谱法第八十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日(1)柱子的热稳定性通常可以在程序升温条件下以基线的漂移量来测量。程序升温的最终温度根据各类固定液的最高使用温度和制柱技术不同而确定。为了避免检测器污染，一般应该比最高温度低20~30C(2)考察柱子的热稳定性还可以采用高温使用后测定下列参数的变化率：组分的容量因子（固定液分解程度）。每米柱长理论塔板数（液膜均匀性是否破坏）。

Grob试样中组分的保留情况（检查固定液和去活层是否化学变化）。

第六章色谱法第九十页，共一百九十三页，2022年，8月28日固定液的极性

1966年由Rohrschneider提出，后由McReynolds做了修正的“相特征参数”是气液色谱中研究被分析物分子和固定相分子之间相互作用力的一项重要指标，它反映了固定液对各种类型化合物的分离选择性，也代表了固定液的平均极性，是至今公认的评价和分类固定液和针对分析任务有效选择固定液的一个好方法。第六章色谱法第九十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日它规定五种溶质在极性固定液和非极性固定液上保留指数的差值，来作为评价固定液选择性和极性的量度，即：苯正丁醇戊酮-2

硝基丙烷吡啶第六章色谱法第九十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日

其中Ip是相应溶质在极性固定液上的保留指数，Is是该溶质在非极性固定相角鲨烷上的保留指数。保留指数是由Kovats提出的，他把某组分的保留值用两个靠近它的的正构烷烃来标定。定义正构烷烃的保留指数为该分子碳原子数的100倍，某一组分的保留指数为：（15）

、、分别代表被测组分和具有Z和Z+n个碳原子数的正构烷烃的调整保留时间，n可以是1、2、3。第六章色谱法第九十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日常数化合物结构特征相互作用力特征代表性化合物易极化，电子给予体化合物色散力，并具有较弱的质子接受能力芳烃、烯烃含羟基、质子给予体形成氢健的化合物既具有质子给予体又有接受质子能力的定向力醇、腈、卤化物含羰基，定向偶极质子接受体化合物只具有质子接受能力的定向力酮、脂、醛、醚、环氧化物、二甲胺衍生物含强极性基团电子接受体化合物偶极定向力硝基化合物、腈类衍生物质子接受体化合物具有强的质子接受能力的弱偶极定向力芳香类碱McReynolds常数表征的分离选择性苯正丁醇戊酮-2硝基丙烷吡啶第六章色谱法第九十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日仪器系统气路系统，进样系统，温控系统，检测器，数据收集和处理系统。毛细管柱气相色谱仪基本流程第六章色谱法第九十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日（1）气路系统气路系统要求能够提供稳定的流速和纯的载气（1%精度）。因为流速对分离影响很大，载气杂质会影响分离或者破坏固定液膜。气路不得漏气。与填充柱不同：（a）毛细管柱进柱前有一个分流气路，目的：控制进入柱子内的样品量，提供大量溶剂放空以避免柱子过载。第六章色谱法第九十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日（b）柱后进检测器前有一个尾吹气路，以减小柱出口至检测器之间过渡管线以及接头区的死空间，防止分离后组分堆积和重新混合造成的不利影响。并使单位时间内进入检测器的样品量增多，提高灵敏度。尾吹气过小，组分到达检测器的时间长，增加谱带扩宽；尾吹气过大，柱出口端阻力增大，延长了组分在柱子内的停留时间，使柱子内组分谱带扩宽，同样会影响分离效能和检测灵敏度。第六章色谱法第九十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日（2）进样系统分流进样将样品在汽化室内汽化并和载气均匀混合，然后分成两个部分，一小部分进入色谱柱，大部分通过放空管线放空。这两部分比例称为分流比。调节放空管线的气阻或者放空气阀可以控制分流比。根据两个流路的载气流速可以测定分流比，其变化范围很大，从1：10到1：500乃至更大。分流进样器要保持恒定进样温度，保证样品汽化和均匀混合，实现线性分流，即样品中各组分都被准确分成相同比例，而与其化学物理性质和浓度无关。第六章色谱法第九十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日对稀溶液中痕量组分的测定可以采用不分流进样，关键是设法排除大量溶剂对微量组分的干扰。对一些热和化学稳定性差的样品，如生物样品，可以用冷柱头进样，即直接将样品送到柱子顶端而没有隔膜，没有样品分流、没有样品瞬间激烈蒸发过程的“冷”进样方式。操作条件必须严格控制，否则大量样品的注入容易引起柱子失效。对于一些微量或者痕量易挥发物质的分析（如血样、环境土样等），可以采用顶空进样方式，即气态进样，从而可以避免大量样品基体对柱子系统的影响，也便于自动化。第六章色谱法第九十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日（3）温控系统温度变化1C，保留时间变化5%左右，因此要求控温尽可能好。要求升温和降温的速度快，控温精度高（±0.1C），保温性能好，柱箱内温度分布均匀。目前国内外多采用空气浴双腔式风道结构，用大功率电阻丝加热，可控硅控温。采用数控技术，提供多阶升温程序，升温速率可在0.1~40C/min范围，柱温调节稳定性可达±0.1C。第六章色谱法第一百页，共一百九十三页，2022年，8月28日（4）检测器能够用于气相色谱的检测器有十多种，但是适用于毛细管气相色谱的有：氢火焰离子化检测器（FID）电子捕获检测器（ECD）火焰光度检测器（FPD）热离子化检测器（TID）

检测器分为浓度型（ECD）和质量型（FID、FPD、TID），浓度型响应信号和样品进入检测器的浓度成正比，峰高不随载气流速变化而变化，但是峰面积会受影响；质量型信号和进入检测器的样品的物质的量有关，载气流速影响峰高，但是不影响峰面积。

第六章色谱法第一百零一页，共一百九十三页，2022年，8月28日检测器的基本性能参数有：灵敏度：信号值随样品组分浓度或者质量的变化率。即以信号值对被测组分量作图，得到以通过原点的直线，斜率即为灵敏度。敏感度：仪器灵敏度高，噪音也随之增大，使微量组分的信号仍难以辨认。因此性能好的检测器不仅要求灵敏度高，还要求噪音小。定义敏感度为检测器给出信号等于两倍噪音时所需进入检测器的组分量。

实际测定的样品敏感度和检测器的最小检测量以及色谱柱的性能和操作条件有关。毛细管气相色谱的敏感度接近仪器的最小检测量。第六章色谱法第一百零二页，共一百九十三页，2022年，8月28日线性范围：

信号值随样品量变化呈成直线部分所对应的最大量和最小量之比。毛细管柱因柱容量小，通常其工作范围小于检测器本身的线性范围。响应时间和死体积：

响应时间要求快，死体积小稳定性：

检测器对所分析的组分必须表现化学惰性，特别是极性组分在检测器内不被催化分解或者吸附，这在痕量分析中尤为重要。第六章色谱法第一百零三页，共一百九十三页，2022年，8月28日氢火焰离子化检测器（FID）

工作原理：氢气在空气中燃烧的火焰作为能源，载气和氢气从喷嘴进入检测器，助燃空气从四周导入，当分离后的有机物组分随载气进入火焰时被解离成正负离子，在电场作用下各自向相反的电极移动形成电流。

特点：灵敏度高，基流小，死体积小（<1nl），响应快(1ms)，线性范围宽(107)，对载气流速和检测器温度波动不敏感，结构简单，稳定可靠。只对含碳有机物有响应，属于质量型检测器。第六章色谱法第一百零四页，共一百九十三页，2022年，8月28日电子捕获检测器（ECD）

工作原理：当载气（一般是氮气、氩气）分子通过检测器时，在放射源（通常是b射线）的辐射下电离成正离子和电子。电子移动速度快，与正离子复合的几率小。在电场作用下电子被阳极吸收形成10-9~10-8A的基始电流，在记录仪上画出基线。当电负性的组分进入检测器时捕获电子形成负离子，由于负离子移动速度和正离子相当，正负离子复合的几率比正离子和电子的复合几率高105~108倍。正负离子复合降低了检测器内的电子浓度，使基始电流下降，产生以负峰形式存在的信号。第六章色谱法第一百零五页，共一百九十三页，2022年，8月28日

对于电负性强的混合物。例如卤化物、含硫含磷混合物、金属有机化合物、硝基以及共轭双健混合物等具有很高的灵敏度。相反，对于一些烃类和生物活性混合物灵敏度很低或者没有响应，属于选择性检测器。第六章色谱法第一百零六页，共一百九十三页，2022年，8月28日ECD的灵敏度除了和被测组分的种类结构不同（表现为电子吸收系数不同）有关之外，还取决于：（1）组分在检测器内捕获电子的几率大小；（2）放射源放出电子数即基流的大小。这两者取决于检测器的结构、放射源的特性、实验条件包括极化电压、使用温度、载气种类及其纯度等多种因素的影响。和FID相比，ECD线性范围较窄（104~105），受检测器温度影响大（要求控制在±0.1C），载气和尾吹气都要求严格脱水脱氧，操作条件要求严。第六章色谱法第一百零七页，共一百九十三页，2022年，8月28日火焰光度检测器（FPD）这是一种对硫和磷具有特高灵敏度的质量型检测器。工作原理：含硫或者磷的混合物载富氢火焰（H2：O2=5：1）中燃烧时，将分别发出394nm和526nm的特征光，通过相应波长的滤光片送至光电倍增管，将光强信号转化成电流信号，再经过微流放大器放大后得到所需要的记录信号。对硫、磷的最小检测量分别为5~5010-12g/s和510-13g/s。第六章色谱法第一百零八页，共一百九十三页，2022年，8月28日热离子化检测器（TID）也称碱焰离子化检测器（AFID）或者氮磷检测器（NPD），是一类破坏型的质量型检测器。其结构和FID相似，不同之处是在火焰喷嘴的上方和收集极之间加一碱盐源，常用硅酸铷Rb2SiO3或者硅酸铯Cs2SiO3制成的玻璃或者陶瓷珠。第六章色谱法第一百零九页，共一百九十三页，2022年，8月28日工作原理：碱盐在加热的情况下蒸发和电离，产生离子基流，当氮磷等杂原子进入检测器时，处在高温下的碱盐会加速蒸发和电离，使离子流增大，响应值与单位时间进入检测器的氮磷质量成正比。对氮磷的最小检测量和线性范围分别为：10-13g/s,105和510-14g/s,104，对含氮磷的化合物具有很高的选择性和灵敏度。第六章色谱法第一百一十页，共一百九十三页，2022年，8月28日（5）数据收集和处理系统最重要和常用的功能是对色谱图和数据进行处理，包括：将检测器输出的模拟信号通过A/D快速转换为数字量，并存入电脑。进行基线平滑和噪声滤波，以有利于正确识别峰和消除基线飘移等对定量带来的影响。识别色谱峰。求取峰参数，包括保留时间、峰高、峰面积、半峰宽、分离度等求保留指数，供鉴别组分定量计算打印报告。第六章色谱法第一百一十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日毛细管气相色谱分析方法的选择和优化

色谱柱的选择1、固定相固定相的选择，取决于分析样品的类型和对样品所要求达到的分辨能力以及分析时间等。要点：（1）选择性好。（2）稳定性和重现性好。（3）便于有效涂制和交联固化。第六章色谱法第一百一十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日

固定液对组分的分离选择性，是由固定液与样品分子间不同的作用力造成的。固定液的选择可以利用麦氏常数来进行，考虑被分离样品中组分所含的官能团类型，首先选择极性相似的固定液。为了增加固定相的稳定性和选择性，有时候也可以采用极性和非极性混合固定相。对于一些特殊的分离对象，如复杂的异构体和光学异构体的分离，可以选择高分子液晶、大环固定相和手性固定相。第六章色谱法第一百一十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日2、柱材料一般使用石英毛细管柱，主要局限是价格贵点，目前商品化柱常用内径为0.53mm、0.32mm。玻璃柱拉制容易，可以得到不同内径的柱，缺点是表面处理要求高。对于一些非极性的低分子量烃类的分析，可以采用耐用的不锈钢或者塑料柱，主要缺点是内壁不均匀、存在活性点、塑料管热稳定性差。第六章色谱法第一百一十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日3、去活化方法去活化对提高柱效和延长柱寿命十分重要。要求：有效覆盖活性点，同时要适合于固定液涂渍（与固定液极性有关）。用八甲基环四硅烷在高温下开环，并在痕量水的作用下与玻璃和石英表面硅羟基形成缩合层可以有效掩盖活性点，适用于非极性和中等极性硅油类固定液。对于极性固定液，选择含有固定液相同功能基团的环硅烷，对相应的极性固定液能够有效润湿和去活。第六章色谱法第一百一十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日4、柱长、柱内径和液膜厚度通常15~30米的柱子已可以对大量分析任务获得满意结果。对于特别复杂的化合物可以考虑采用50米柱长。液膜厚度的选择，应该和柱内径相联系。一般内径d与液膜厚度df的比值，大约在4000~2000之间。薄的液膜分析时间短，柱子性能和载气粘度及分配系数的依赖性小，但是柱容量小，对准确进样和痕量分析不利。当所需样品进样量大时，应使用大口径厚液膜柱。第六章色谱法第一百一十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日

操作条件选择和优化1、载气及流速从速率方程可知，载气的种类主要通过溶质在其中的扩散系数Dg影响分子的纵向扩散和气相传质阻力，因此选择载气主要考虑Dg。在薄液膜毛细管柱上，选用大于最佳流速时，主要考虑气相传质阻力的影响，此时应该选用对样品有较高扩散系数的低密度气体如氢气和氦气；相反，如果更加强调柱效，需要在最佳流速附近工作，这个时候纵向扩散起主要作用，则应该选择高密度气体，如氮气、氩气等。对于使用ECD检测器，需要高纯的氮气和氩气。第六章色谱法第一百一十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日

线速则既影响分子的扩散也影响气液两相传质阻力。在H~u曲线上，有一个最低点表明组分可以达到的最高柱效，这个时候对应的线速称为最佳流速uopt。实际分析中常用最佳实用线速uopt,g，它可以由曲线的切点求得，如图：实用线速的求算

第六章色谱法第一百一十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日

在流速大于实用流速时，主要受传质阻力影响。在高线速区，板高正比于线速，即在高线速下实现快速分离，是以牺牲柱效为代价的，但是可以适当通过增加柱长和减小内径来得到弥补。采用高线速，对于质量型检测器可以得到较高色谱峰，使最小检测浓度减小。第六章色谱法第一百一十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日2、温度的选择柱温是最重要的操作参数，直接影响分离效能和分析速度。提高柱温，有利于加速组分在气-液相中的传质速率，使柱效提高。但同时也加剧了纵向分子扩散，故应该适当提高线速，以抑止这种不利因素。柱温升高还使选择性降低，从而使总的分离效能降低。第六章色谱法第一百二十页，共一百九十三页，2022年，8月28日

对于沸程不太宽的样品，柱温的选择可以参照下述几条原则：高沸点混合物（300~450C），当采用薄液膜和高灵敏度检测器（FID）时，可以选用180~260C柱温。中等沸点混合物（200~300C），柱温比其平均沸点约低120C，可选用80~200C柱温。低沸点混合物（100~200C），柱温比其平均沸点约低50C，可选用50~100C柱温。气体样品，在气-液分配毛细管柱上可以在50C或者室温下分析。第六章色谱法第一百二十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日

汽化室温度的选择，取决于样品的化学稳定性、沸程范围、进样量和进样方式。使用分流进样形式时，汽化室温度一般高于柱温50~100C，以保证快速、完全汽化。对于某些高沸点，热稳定性差的试样，在高于或者接近其沸点时已有可能分解，这时应增加分流比，减小进入柱子的试样量，在大量载气稀释下，极微量样品能够在低于沸点温度下瞬间汽化。

检测器温度，一般应该高于柱温，以防止污染和出现异常响应。第六章色谱法第一百二十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日3、程序升温和程序升流在恒温时，当被测样品复杂，其中的组分的k′范围过宽，而分离在恒温下进行，这往往会带来两个麻烦。首先是高沸点样品保留时间过长，而使色谱峰既宽又矮，使分离变坏，且难以准确定量。更严重的是某些高沸点组分迟迟不流出。若对未知样品，则会误认为组分已全部洗脱出柱，但到了以后的分析中，它又被洗脱出来，造成组分的漏检和误检。其次对沸点过低的组分，峰会相互紧挨，而不能很好分离。第六章色谱法第一百二十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日

这个问题可以通过程序升温和程序升流来解决。在程序方法中，保留时间和沸点的关系在最佳条件下近似为线性，即随着温度和流速的增加，峰宽仅有很小的增加，或者几乎不变。这样既能改善先出峰之间的分离，又能够使后流出的峰保持尖锐和所需要的检测灵敏度。第六章色谱法第一百二十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日

程序升温广为使用，包括初温、程升、保持和终温等程序。根据随时间变化的加温方式的不同可以分为线性和非线性程序升温，后者用得不多。在线性程序升温中又分为一阶程升和多阶程升。在程序升温中，各组分均在其最佳柱温下流出。毛细管柱上组分的最佳柱温大约比其沸点低50C左右。为了在程序升温中能够更好权衡分离和分析速度，需要对下列参数进行优化：第六章色谱法第一百二十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日（1）初温：取决于最早流出峰的分离度。一般要低于样品中最低沸点组分的沸点，相似于这些沸点组分做等温分析时采用的温度。较低初温可以忽略对高沸点组分分离的影响，因为此时高沸点组分在早期程序升温中处于冻结状态。另外，初温的选择应该高于固定相的玻璃化温度（凝固温度），否则将柱效降低。第六章色谱法第一百二十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日（2）升温速率s：使最大分离度有一个慢的变化，而最小分析时间有一个快的变化。毛细管程序升温一般采用较低的升温速率0.5~6C/min。升温速率范围的限制取决于固定相的热稳定性和流速变化。（3）载气流速F：等于或者高于恒温色谱中的最佳线速，并要和升温速率相适应，使s/F为常数较好。对于恒压控制仪器，流速（流量F）将随着温度的升高而减小，从而影响浓度型检测器的响应值。因此，选择程序升温操作的仪器应该有恒流控制器，在整个程序升温过程中必须用稳流阀严格控制流速恒定。第六章色谱法第一百二十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日

在毛细管气相色谱中流量较低，所以s/F比值高。s、F及其比值的大小对色谱性能的影响可以归结为如下几点：升温速率对保留值大的组分影响大；保留时间要求严格则升温速率必须恒定；保留时间小的组分重复性取决于流速的稳定性，而受升温速率的影响不大；s/F越小，分离度越大。由于毛细管柱F小，所以只需要较小的升温速率即可保持最佳分离度；升温速率大，影响固定液的寿命，因为固定液的蒸汽压随温度升高以指数函数形式加大。第六章色谱法第一百二十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日（4）终温终温的确定主要取决于固定相和样品的热稳定性以及样品中组分的最高沸点。高温固定相和固化固定相对提高上限温度有明显的改善。第六章色谱法第一百二十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日内容恒温程序升温样品沸点范围沸点范围小于120C70~420C样品组分数>10分析速度慢快检测限随峰形变化很少变化进样速度快不必很快具体随进样方式而定固定相选择能广泛选择选择范围有限尽量选用交联键合固定相载气纯度不严格要求纯度高流速控制只需恒压必须恒流毛细管气相色谱程序升温和恒温的比较第六章色谱法第一百三十页，共一百九十三页，2022年，8月28日

载气的程序升流，也称压力程升，由Lipsky提出，通过改变柱入口压力，使柱内载气的平均流量随时间变化，这种变化可以是线性的，可以是指数曲线增加的。程序升流是改变分离条件的很方便的方法，对宽沸程混合物的分析时间更短，而且可以在较低柱温下工作，大大减少柱流失。第六章色谱法第一百三十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日

和程序升温相比，更适合分离热不稳定化合物，还可以得到更为稳定的基线和延长柱子的寿命。因为固定相的蒸发速率与流量只呈线性关系，而与温度却呈指数关系变化。在程序升流操作中，柱内压力变化很快恢复至仪器初始状态，能够提高单位时间内的分析次数。缺点是对后流出峰柱效下降，当采用氢气或者氦气时柱效降低不明显。对于流速敏感的检测器（TCD、FPT）难于校正。第六章色谱法第一百三十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日

程序升流中参数的选择主要考虑分离能力和分析时间两方面。对于一般长度为15~25米的毛细管，程序升流范围大约在0.1~10ml/min较为合适。为了使毛细管柱获得最大分离能力，也可以同时采用程序升温和程序升流。第六章色谱法第一百三十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日

4、进样量进样量不得超过最大进样量。最大进样量又称为样品容量，定义为柱效下降10%时的进样量，与固定液量有关。进样量超过柱子容量后柱效会下降。第六章色谱法第一百三十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日

毛细管气相色谱的应用（1）环境污染物分析：大气、水样、农药残留、土壤与食品、香烟烟气、（2）石油化工与地质（3）生物、医学：昆虫信息素、微生物（脂肪酸）、临床（氨基酸、糖、有机酸、甾体激素等）、药物分析（4）天然产物：香料、精油、中草药、（5）食品酿酒：风味与香气、肉质、水果蔬菜、饮料等第六章色谱法第一百三十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日第六章色谱法第一百三十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日第六章色谱法第一百三十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日第六章色谱法第一百三十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日第六章色谱法第一百三十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日6.3高效液相色谱特点：（1）采用数m微球填料，传质快，柱效高；（2）封闭式可重复使用上百次、数千次的色谱柱；（3）高压输液泵，快速；高精度连续操作仪器化，定性定量分析准确度高；（4）流动相影响组分的分配，有限的几种和几十种固定相就可以解决相当大范围的问题；（5）样品回收容易而且是定量的，有利于制备；（6）柱外效应对柱效的影响特别严重。第六章色谱法第一百四十页，共一百九十三页，2022年，8月28日1固定相和流动相（1）固定相按照承受压力来分：

刚性固体－硅胶等，耐高压，表面可键合各种功能团

硬胶－聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，承压能力低，主要用于离子交换和尺寸排阻色谱第六章色谱法第一百四十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日（2）流动相纯度高粘度低化学稳定性好沸点高于55ºC

溶剂要完全浸润固定相与检测器匹配混合溶剂要考虑互溶性从有机溶剂到水溶液，既可以是纯溶剂，也可以是二元或多元混合溶剂。第六章色谱法第一百四十二页，共一百九十三页，2022年，8月28日根据分子作用力的情况，溶剂一般分为八类：脂肪醚，纯质子接受体；脂肪醇，质子接受-给予体；吡啶衍生物，四氢呋喃，质子接受体，易极化；乙二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺，质子给予体；二氯甲烷、二氯乙烷，大偶极钜；脂肪酮、脂、二氧六环；芳烃、芳醚、硝基甲烷氟代醇、氯仿、水，质子给体

为了使混合溶剂的选择性差别尽可能大，应选用不同类型混合的混合溶剂。第六章色谱法第一百四十三页，共一百九十三页，2022年，8月28日2各种HPLC方法正相色谱反相色谱

液-固吸附色谱液-液分配色谱离子交换色谱大小排阻色谱亲和色谱……第六章色谱法第一百四十四页，共一百九十三页，2022年，8月28日反相色谱应用最广泛：在水中可以加入各种添加剂，改变流动相的离子强度、pH和极性等，以提高选择性。水的截止波长低，有利于痕量组分的检测。反相键合相稳定，不易被强极性组分污染。利用二次化学平衡，可以使不能直接用反相色谱分离的组分用反相色谱分离，例如离子对色谱。第六章色谱法第一百四十五页，共一百九十三页，2022年，8月28日反相色谱分离机理:

疏溶剂理论：当一个非极性分子或者溶质分子中的非极性部分和极性溶剂接触时，相互产生斥力，自由能增加，分子中非极性部分的取向导致溶剂中形成一个空腔。空腔的形成和面积大小与溶剂性质（表面张力、介电常数等）以及溶质的表面积和偶极钜有关。第六章色谱法第一百四十六页，共一百九十三页，2022年，8月28日

溶质保留影响因素：（1）溶质分子中非极性部分的总面积；（2）键合相上的非极性部分的总面积；（3）流动相表面张力增大，洗脱能力变弱；（4）盐加入，增加表面张力，减少溶质分子间的静电斥力。对于非极性溶质，盐浓度增加，表面张力增大，保留增大；对于极性溶质，随盐浓度增大减小。（5）缓冲溶液pH（6）温度第六章色谱法第一百四十七页，共一百九十三页，2022年，8月28日（1）反相离子对色谱实现了强极性电离型化合物的反相色谱分离。羧酸、磺酸、胺、季胺盐、氨基酸、多肽、核酸及其衍生物、各种药物、染料的分离分析第六章色谱法第一百四十八页，共一百九十三页，2022年，8月28日分配系数为：分配比（分配容量、容量因子）为：第六章色谱法第一百四十九页，共一百九十三页，2022年，8月28日

加入有机溶剂可使亲脂性离子对稳定性提高：

假设只有溶剂化离子对存在于固定相中：

选择合适的有机溶剂能够获得高平衡常数KS，将提高溶质的分配容量和分离选择性。第六章色谱法第一百五十页，共一百九十三页，2022年，8月28日影响离子对色谱保留的因素：

pH

离子对试剂的性质（链长）和浓度有机溶剂离子强度影响－离子强度的增加，离子对的保留值下降，而中性溶质的保留值趋于上升。金属离子温度第六章色谱法第一百五十一页，共一百九十三页，2022年，8月28日（2）尺寸排阻色谱一般说来，在生物化学领域常用水溶性溶剂，称为凝胶过滤色谱（Gelfiltration）；在合成高分子化学领域，采用有机溶剂较多，常称为凝胶渗透色谱（GPC，Gelpermeationchromatography）。实际应用中，常用的名称是尺寸排阻色谱（SEC，Sizeexclu