临床微生物学检验：衣原体检验

衣原体检验第十八章重点衣原体的生物学特性衣原体的实验室检查关键词：生活周期衣原体是一类有独特发育周期，专性活细胞内寄生，能通过细菌滤器的原核细胞型微生物。广泛寄生于人类和动物中，仅少数能致病。电镜观察衣原体基本结构有细胞壁、细胞膜和拟核。细胞壁主要由肽聚糖、外膜和脂多糖组成，与革兰阴性菌细胞壁相似。1935年宫川米次等从腹股沟淋巴肉芽肿患者的染色体中作为宫川小体而发现的，我国学者汤飞凡于1955年首先成功分离鉴定出沙眼衣原体。第一节概述伯杰分类法：衣原体目衣原体科衣原体属

沙眼衣原体：3个变种肺炎嗜衣原体：4个亚种鹦鹉热嗜衣原体

兽类衣原体第一节概述按分子生物学特性的分类法：（以16S和23S的rRNA基因序列进行分类基础）

第1科（衣原体科):分为2个属9个种。第2科（Simkaniaccae):第3科（副衣原体科):第4科（Waddliaceae):第一节概述衣原体科衣原体属(3个种)沙眼衣原体鼠衣原体猪衣原体嗜衣原体属(6个种)肺炎嗜衣原体鹦鹉热嗜衣原体兽类嗜衣原体流产嗜衣原体猫嗜性衣原体豚鼠嗜性衣原体特征1.革兰阴性，圆形或椭圆形体；2.具有细胞壁，其组成与革兰阴性菌相似；3.同时含DNA和RNA两种核酸；4.有核糖体和较复杂的酶类，能进行多种代谢，但缺乏供代谢所需的能量来源；5.专性细胞内寄生，有独特的发育周期，行二分裂方式繁殖；6.对多种抗生素敏感。

第一节概述衣原体（血清型）感染部位所致疾病沙眼衣原体（A，B，Ba，C）眼沙眼沙眼衣原体（D~K）眼包涵体结膜炎沙眼衣原体（D~K）眼新生儿眼炎沙眼衣原体（D~K）生殖道（男）尿道炎、附睾炎、直肠炎

输卵管炎、不育、肝周炎沙眼衣原体（D~K）生殖道（女）尿道炎、宫颈炎、直肠炎、

阑尾周围炎鹦鹉热嗜衣原体（羊株）生殖道（女）流产、死产沙眼衣原体（L1~L3）生殖道性病淋巴肉芽肿沙眼衣原体（D~K）呼吸道婴儿肺炎肺炎嗜衣原体呼吸道咽炎、肺炎鹦鹉热嗜衣原体（鸟株）呼吸道鹦鹉热鹦鹉热嗜衣原体（羊株）呼吸道肺炎主要病原性衣原体第一节概述第二节沙眼衣原体沙眼---局部炎症:早期流泪、有粘液脓性分泌物、结膜充血及滤泡增生;晚期结膜瘢痕、眼睑内翻、倒睫以及角膜血管翳导致视力下降或致盲。人类是其主要宿主可引起多种疾病，其中以沙眼最常见，能致盲沙眼亚种15个血清型(A,B,Ba,C,D,Da,E,F,G,H,I,Ia,J,Ja,K)性病淋巴肉芽肿亚种4个血清型（L1，L2，L2a，L3）鼠亚种

不侵犯人第二节沙眼衣原体临床意义沙眼：通过眼-手-眼途径直接或间接密切接触传播。致盲，由

沙眼亚种血清型A,B,Ba,C感染。包涵体结膜炎：经产道或污物接触而感染。由沙眼亚种血清型

B,Ba,D,Da,F,G,H,I,Ia,J及K感染。泌尿生殖道感染：非淋菌性泌尿生殖道感染，经性接触传播，

沙眼亚种D,Da,E,F,G,H,I,Ia,J及K感染。性病淋巴肉芽肿亚种：侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结

炎和慢性淋巴肉芽肿。性病淋巴肉芽肿

亚种L1，L2，L2a，L3感染。呼吸道感染：多见婴幼儿，沙眼亚种D,Da,E,F,G,H,I,Ia,J及K感染。第二节沙眼衣原体预防：目前无特异性预防方法，主要应注意个人卫生，避免直接或间接触传染源。预防泌尿生殖道感染应搞好性病知识的宣传教育及时治疗。治疗：可选磺胺类、大环内脂类和喹诺酮类抗生素。微生物特性原体较小，Giemsa染色呈紫色，呈圆形或椭圆形，细胞壁致密，具有特殊的发育周期。始体Giemsa染色呈蓝色，二分裂增繁殖。包涵体具有多形性，碘染色后呈褐色。专性细胞内寄生，可接种鸡胚卵黄囊中生长繁殖，也可以在组织细胞内培养。微量免疫荧光法根据型特异抗原把三种亚种分为不同的血清型。第二节沙眼衣原体发育周期与形态染色宿主细胞破裂，释放出的原体则感染新的细胞具有感染性的原体通过胞饮作用进入宿主细胞发育周期原体(EB)始体(RB)2-3天

性状原体始体

形态球形或椭圆网状大小（um）0.2－0.4

0.5－1.0细胞壁+

-代谢活性-

+胞外稳定性+

-感染性+

-繁殖能力-

+染色性(Giemsa)

紫色

蓝色第二节沙眼衣原体衣原体在易感细胞内繁殖后所形成的含有大量始体和子代原体的空泡，辅助鉴别衣原体。Giemsa染色呈深蓝色。包涵体第二节沙眼衣原体包涵体1.属特异抗原－脂多糖，位于细胞壁2.种特异抗原－主要外膜蛋白（MOMP）3.型特异抗原－MOMP氨基酸可变区，分型依据抗原结构1.耐冷不耐热;2.对红霉素、四环素、利福平敏感;3.对常用消毒剂敏感.

抵抗力第二节沙眼衣原体患者，女，22岁。结婚后2年余始终未孕。医院妇科看病，白带量稍多，色微黄，无明显异味。偶有外阴瘙痒及尿频，尿急，尿痛。体查：宫颈轻度糜烂伴少许脓性分泌物。实验室检查：血常规正常，尿常规：WBC12/HP，中段尿细菌培养无菌生长。临床案例怎么检查？

标本（链霉素处理）

直接涂片培养核酸检测Mac-Gie-

甲碘荧光乳胶鸡胚细小核Pchia-msa

醛染标记吸附卵黄胞白酸CVello

染色固色单克单克囊接培鼠杂R染色定隆抗隆抗种养接交体染体种

查衣原体色查包涵体

镜检直接观察血清学试验(MIF、CF、ELISA)第二节沙眼衣原体

标本的采集（1）眼和泌尿生殖道①沙眼和包涵体结膜病人：用拭子用力涂擦患部或眼结膜刮片。②沙眼衣原体尿道炎：因仅感染柱状及鳞–柱状上皮细胞，故应选择宫颈的移行部位，深入阴道3～4cm处取样。③输卵管炎患者——用注射针头，自输卵管吸取。④小儿肺炎——用拭子在鼻咽后部或咽喉采集。

（2）性病淋巴肉芽肿①采集淋巴结脓汁。②直肠拭子。③活检材料。微生物学检查法检验方法（1）标本的直接检查①直接镜检——查包涵体。眼结膜、尿道及子宫上皮细胞内发现有包涵体很有诊断价值。a．Giemsa染色

原体——染成紫红色。网状体——蓝色。b．免疫荧光检查。②抗原检测胶体金标记衣原体抗原检查：2023/3/9胶体金标记抗衣原体脂多糖单克隆抗体（小鼠IgG）固相抗衣原体抗体固相抗小鼠IgG抗体③核酸检测

1)核酸杂交：用125I标记的衣原体rDNA探针检测宫颈标本

的敏感性和特异性，与培养相比分别为82.8％和99.4％。2)PCR：具有高度敏感性和特异性。一般按沙眼衣原体

7.5kb质粒、MOMP序列及16SrRNA基因序列设计引物。④抗体检测1)补体结合试验2)微量荧光免疫试验3)酶免试验⑤分离培养和鉴定接种鸡胚卵黄囊或传代细胞，用直接免疫荧光法或酶联免疫法检测。1）细胞培养将标本拭子，用含抗生素的稀释液制成10％-20％悬液。分离的细胞有McCoy、Hela-229细胞等。置5％CO2下培养。初代分离培养72-96h后传代或盲传。有症状病人90％标本第1代即可见包涵体，而无症状病人需传代后才得到阳性。敏感性为80％-90％，特异性100％，是目前确诊最可靠的方法，而且是评价实验室诊断法的标准。2）鸡胚培养有细菌污染的临床标本加适当的抗生素(如链霉素、庆大霉素和制霉菌素等)肉汤，在室温中作用lh后，接种3-4只孵育7天的鸡胚卵黄囊，35℃孵育，观察至13天，收获卵黄囊涂片，作Gimenez染色，镜检原体。3）鉴定将细胞培养盖片用Giemsa或碘染色镜检胞质内包涵体。Giemsa染色比碘染色敏感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考。可用型特异性荧光血清鉴定其型别。对于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧光法鉴定原体或补体结合抗原。

1989年定名。生物学性状与其它种衣原体相差较大，碘染色阴性，对磺胺耐药。经飞沫（呼吸道）传播，也可引起院内感染。主要引起青少年急性呼吸道感染，以肺炎多见，也可致气管炎、咽炎。肺炎衣原体慢性感染可能与冠心病有关。第三节肺炎嗜衣原体生物学性状1．电镜下观察原体呈典型的梨形，并有清晰的周浆间隙,

无质粒DNA。2．有独特的生活周期，但始体疏松。3．与沙眼衣原体、鹦鹉热嗜衣原体DNA同源性＜10%，不

同来源的TWAR株都有94%DNA同源性，而且限制性内切

酶的图谱相同。4．只有一个血清型。98kDa蛋白质为特异性抗原。5．TWAR株用HEp-2和HeLa细胞系分离和传代，鸡胚对其不

敏感。第三节肺炎嗜衣原体

微生物学检验1．标本采集（1）咽拭标本（2）支气管肺泡洗液。（3）由气管镜采集气管内痰液或肺泡灌洗液。2．标本直接检查（1）直接镜检：方法同沙眼衣原体实验室诊断。（2）TWAR特异性核酸的检测。第三节肺炎嗜衣原体

微生物学检验3．分离培养和鉴定１)分离肺炎衣原体的细胞：选择HEP-2和H-292细胞系。２)培养方法：首先制备H-292/HEP-2单层细胞接种标本，三瓶，室温1700×g离心20～30min→弃上清→换培养液取出一瓶涂片,盖片→固定,用单克隆抗体作直接或间接法荧光染色→观察、计算包涵体数目。如第一代包涵体阴性→育传至第3代（接种和培养条件同上）48h取片、染色、镜检。3)鉴定：根据第3代培养结果，以出现包涵体与否作出最终的阳性/阴性报告。第三节肺炎嗜衣原体

微生物学检验4．血清学试验－抗体检测1)补体结合试验（CF）

最常用的血清学方法2)酶联免疫吸附试验(ELISA)特异性强、敏感性差。3)微量免疫荧光抗体试验（MIF）对肺炎嗜衣原体的诊断是特异的且敏感性高。MIF抗体包括3

种：IgM、IgG和IgA。第三节肺炎嗜衣原体无论采用何种检测方法，急性期及恢复期的双份血清标本中，肺炎嗜支原体特异性抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时，均可确诊为肺炎嗜支原体感染，这是目前国际上公认的标准。首先从鹦鹉中分离出来，引起的感染成为职业病。生物学性状与沙眼衣原体相似。最适生长温度为39度，碘染色阴性，对磺胺耐药。耐热抗原与沙眼衣原体LGV亚种有交叉反应。鹦鹉热衣原体通过气溶胶经呼吸道传播，主要引起呼吸道感染和肺炎。第四节鹦鹉热嗜衣原体临床意义鹦鹉热嗜衣原体主要感染动物。

人：典型临床表现为非典型肺炎。

急性发病、发热、头痛、喉痛、不适。T38℃，很快上升到39℃～40℃。咳痰、有时为铁锈色。X线检查肺部有单个或多个实变性阴影。第四节鹦鹉热嗜衣原体微生物学检验1．标本的采集1）病人的血液、痰、咽喉含漱液。2）尸检材料--取肺、脾、肝等组织和腹腔、心包渗出液。

2．标本直接检查①直接镜检：

Giemsa或Machiavello染色法观察衣原体的原体和网状体。Giemsa染色观察包涵体。

②抗原检测免疫荧光法和酶免疫法（EIA）③核酸检测。核酸探针法和PCR

第四节鹦鹉热嗜衣原体微生物学检验3．分离培养①鸡胚卵黄囊：

常用于分离培养和传代。同沙眼衣原体。②小鼠分离：A．腹腔接种B．颅内接种C．滴鼻接种

③细胞培养：常用PL细胞、BHK细胞和Vero细胞等。先接种鸡胚卵黄囊，再转细胞。

第四节鹦鹉热嗜衣原体微生物学检验3．血清学检查-抗体检测1）补体结合试验（CF）2）间接血凝试验（IFA）3)酶联免疫吸附试验(ELISA)4)微量免疫荧光抗体试验（MIF）

第四节鹦鹉热嗜衣原体习题A

沙眼衣原体可以引起性传播疾病B有独特的生活周期，可分为原体和始体C在固体培养基可形成“油煎蛋”样菌落D感染衣原的细胞可发现包涵体E对抗生素不敏感下列有关衣原体描述不正确的是CE立克次体检验第十九章重点立克次体的共同特征致病立克次体的传播媒介和方式关键词：传播媒介

立克次体(Rickettsia)是一类与节肢动物密切相关，专性活细胞内寄生的革兰阴性原核细胞型微生物，是引起斑疹伤寒、恙虫病等传染病的病原体。

纪念美国医师

H.T.Ricketts

而命名。第一节概述分类与命名伯杰分类:

原核生物界薄壁菌门暗细菌纲立克次体目立克次体科

无形体科全孢菌科立克次体属、东方体属埃立克体属、无形体属、新立克体属、沃巴哈属第一节概述常见致病立克次体(伯杰系统细菌学手册第一版)军团菌目根瘤菌目

共同特征1专性活细胞内寄生2含有DNA和RNA两种类型的核酸，二分裂增殖3大小介于细菌和病毒之间，光镜下可见4以节肢动物为媒介或为寄生/储存宿主5人畜共患病的病原体，引起发热出疹性疾病6对抗生素敏感(TE,C)7革兰阴性球杆状CW细胞壁IM中间体CG染色体CM细胞膜第一节概述第二节立克次体属

临床意义——流行性斑疹伤寒

潜伏期（10～14d）高热、头痛、肌肉痛等（4～7d）皮疹神经、心血管和其他器官病变1.普氏立克次体

传染源：

病人，不属于人畜共患病

储存宿主：病人

传播媒介：人虱

传播方式：第二节立克次体属

临床意义——地方斑疹伤寒2.莫氏立克次体临床表现：与流行性斑疹伤寒相似，但病情较轻，

发病缓慢，持续时间短，很少侵害中枢

神经系统。免疫力：病后免疫持久，与流行性斑疹伤寒有交叉

免疫。磺胺类药物可刺激其生长繁殖。传染源：鼠储存宿主：啮齿类动物(主要为老鼠)传播媒介：鼠蚤或鼠虱传播方式：

流行性斑疹伤寒与地方性斑疹伤寒区别莫氏立克次体在形态、染色性、抵抗力以及易细胞、易感动物方面与普氏立克次体相似，只是莫氏立克次体所致的豚鼠阴囊反应比普氏立克次体引起的更强。第二节立克次体属

生物学特性普氏立克次体短杆状，0.8～2.0×0.3～0.6um，单个存在或呈短链排列。在宿主细胞的细胞质内生长。鸡胚高度敏感，接种后于4～13日内死亡。接种豚鼠或家兔睾丸或兔眼前房是保菌的良好方法。对热、紫外线、一般消毒剂很敏感，对低温及干燥抵抗力较强。第二节立克次体属

微生物学检验标本直接检查发病免疫荧光PCR接种豚鼠血清学试验补体结合试验鉴定不发病盲传代微量凝集试验免疫荧光染色常规染色未检出阴性阳性补体结合试验微量凝集试验间接免疫荧光试验ELISA外斐试验第二节立克次体属

微生物学检验1)标本采集：病人血液标本—最常用活检或尸检材料

2）标本直接检查免疫荧光检测核酸检测－按照立克次体的gltA基因设计引物，用PCR方法检测标本中的普氏或莫氏立克次体特异性DNA，具有快速、敏感、特异性强等优点。3）分离培养动物接种分离立克次体－接种豚鼠，观察阴囊肿胀和体

温。鉴定－免疫荧光法鉴定感染动物脏器、鸡胚卵黄囊、细

胞培养物中的特异性Ag或Ab。分离株繁殖与保存－鸡胚卵黄囊培养、细胞培养。-70

度保存。第二节立克次体属

微生物学检验外斐反应IFA试验

ELISA补体结合试验

其它：MA、IHA和LA试验等。4）抗体检测第二节立克次体属

微生物学检验Weil-Felix反应大部分立克次体与普通变形杆菌某些菌株（X19、Xk、X2）的菌体抗原有共同的抗原成分，故可用这些变形杆菌的菌体抗原与不同稀释度的患者血清做凝集反应，诊断立克次体病。立克次体病血清学诊断方法诊断法最低阳性效价(倒数)检出抗体时间特点外斐反应>1602~3周缺乏敏感性及特异性，抗原易得，方法简便IFA16~64，Q热常≥128有现症诊断意义2~3周需用抗原少，群特异性，相当敏感，能区分Ig类别ELISAOD值0.25>对照1周IgM捕捉作早期诊断，适用于大批及微量标本CF8或162~3周不如IFA或ELISA敏感，非常特异，方法繁琐MA≥81~2周抗原纯度要求高，不如IFA敏感，比CF敏感IHA501~2周很敏感，群特异性，只在感染活动期才能检出LA641~2周晚期恢复期血清不敏感，群特异性5)其它检查：血常规:白细胞计数多在正常范围，少数高于10×109/L，

偶有在5×109/L以下。血小板计数下降。嗜酸

性粒细胞显著减少或消失。胸部X线:无特征性改变，可显示肺部斑点状或斑片状渗

出性密度增高阴影，具有一般肺炎或支气管肺

炎影像，偶见叶、段性肺实变阴影。第二节立克次体属

微生物学检验第三节东方体属

临床意义——恙虫病(丛林热)恙虫病东方体临床表现：免疫力：病后免疫持久，以细胞免疫为主。

潜伏期（7～10d）高热、剧烈头痛、耳聋等

红斑样皮疹、水疱、溃疡周围红润，上覆黑色痂皮（焦痂）磺胺类药物可刺激其生长繁殖。传染源：鼠储存宿主：恙螨传播媒介：恙螨传播方式：患者，男，49岁。因持续高热1周入院。体温持续39-40.5度，体检颈胸部皮肤散在丘疹样皮疹，左肩颈部可见一直径1.5cm椭圆形皮损，表面有焦痂中央有凹陷，左颈下淋巴触痛明显。本次发病前1周曾外出广州、汕头等地并在野外山地露宿。临床案例

呈双球状或短杆状，在细胞质内近核处成对或成堆排列，大小为0.3～0.5μm×0.8～2.0μm。对热及化学消毒剂均很敏感，55℃10分钟即失去活力，0.5%石炭酸可迅速将其杀灭；对低温的抵抗力较强。与变形杆菌OXK有共同抗原。第三节东方体属

生物学特性第三节东方体属

微生物学检验1）标本直接检查抗原检测－ELISA核酸检测－已建立了用PCR检测恙虫病立克次体Sta58主要抗原基因片段的方法，具有灵敏度高和特异性强的优点。2）分离培养可取高热期病人全血0.3～0.5ml接种于小鼠腹腔，动物一

般于第10天发病，而于11～16d内死亡。取脾、肝或腹膜

作涂片或印片，经染色（最好用荧光抗体）后可检出位

于单核细胞胞质内的病原体。第三节东方体属

微生物学检验3）抗本检测4）其它检查白细胞计数减少或正常，有并发症时则增多。半数患者

的尿中有蛋白质，偶见红、白细胞及管型。

外斐试验：患者血清可与变形杆菌OXk株发生凝集反应，第1病周围仅30%阳性，第2周末为60%左右，第3、4周可达80～90%。效价自1∶80～1∶1280以上不等，随病程而逐渐增高；第4周后开始下降，至第8～9周多数为阴性。单份血清的诊断意义不大。流行性斑疹伤寒4++-地方性斑疹伤寒4+