十五章生物技术与作物育种

十五章生物技术与作物育种第1页/共62页第十五章生物技术与作物育种第2页/共62页第一节细胞工程与作物育种植物细胞工程：是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门科学。它以细胞为单位，在体外（invitro）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质过程。包括花药培养、体细胞变异筛选、幼胚培养、试管受精和原生质体融合等第3页/共62页理论基础：

细胞的全能性（celltotipotency）。指细胞所具有的形成各种细胞类型的潜在能力。

因为细胞核内有保持物种遗传性所需要的全套遗传物质所以高度分化的体细胞具有发育成一个生物体的能力。第4页/共62页一、植物细胞和组织培养技术（一）培养基及其组成1、培养基的种类和特点（1）MS培养基（2）B5培养基（3）White培养基（4）N6培养基（5）KM-8p培养基（6）SH培养基第5页/共62页2、培养基的成分无机盐和水大量元素C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl微量元素Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na

水蒸馏水、双蒸水或使用去离子水有机化合物

糖碳源和能源氨基酸类有机氮源维生素类维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等生长调节物质

生长素IAA、NAA、2,4-D、IBA细胞分裂素天然：6-BA、KT（激动素，糠基酰嘌呤）人工：ZT（玉米素）、2-iP

赤霉素GA3成份不定物质

椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥琼脂

从海藻中提取的一种高分子碳水化合物第6页/共62页3、培养基的配置(1)水和药品水必须采用蒸馏水或无离子水，药品最好采用分析纯，至少是化学纯药品。(2)母液的配置为方便培养基的制备，现将培养基的各种成份分类配成浓缩的母液，正式配制时按规定用量稀释混合。(3)制备培养基

混合各成分母液熔化琼脂(4)培养基的消毒主要有高温高压灭菌和过滤灭菌两种方法。调pH值分装灭菌放置备用搅拌混匀第7页/共62页4、无菌操作方法（1）消毒剂消毒剂使用浓度（%）消除难易消毒时间（min）消毒效果次氯酸钠2易5~30很好次氯酸钙9~10易5~30很好过氧化氢10~12最易5~15好溴水1~2易2~10很好硝酸银1较难5~30好氯化汞0.1~1较难2~10最好抗生素4~50mg/L中30~60较好第8页/共62页（2）无菌操作（3）无菌培养二、细胞和组织培养与作物育种（一）体细胞克隆变异及其育种利用1、体细胞克隆变异的遗传基础（1）染色体数目变异（2）染色体结构变异（3）点突变2、突变体的筛选第9页/共62页3、在作物改良上应用（1）抗病（2）抗除草剂（3）抗氨基酸或氨基酸类似物（4）耐盐（5）耐旱优良品种细胞培养R0R0群体改良体细胞克隆确定遗传方式遗传稳定性测试田间试验育种新品系多点田间试验区域试验继续田间试验、种子富集审定投入生产利用体细胞克隆变异技术路线第10页/共62页（二）单倍体细胞培养及育种利用1、单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值（1）后代的快速纯合（2）提高选择效率（3）排除杂种优势对后代选择干扰（4）遗传研究的良好实验材料体系（5）突变体的筛选第11页/共62页

母本X父本F1F2品系比较实验区域试验花药培养花药培养加倍选择鉴定杂交育种与单倍体育种周期比较第12页/共62页2、离体培养条件下的小孢子发育（1）营养细胞发育途径（2）生殖细胞发育途径（3）营养细胞和生殖细胞并进发育途径（4）花粉均等发育途径3、影响花药培养的因素（1）供体植株的生长条件（2）供体植株的年龄（3）花粉发育时期（4）花蕾和花药处理（5）培养基（6）培养条件第13页/共62页4、单倍体细胞培养与植物育种

A品种XB品种F1杂种单倍体培养重组纯合体重组了A和B品种优点的纯系遗传稳定性测试新品系品种亲本推广利用杂种优势利用田间测试自交，田间测试确定遗传基础杂交和分离测试选择染色体加倍小孢子培养或花药培养第14页/共62页三、植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。第15页/共62页（一）原生质体的分离原则：保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力，先决条件要有一个合适渗透压。1、分离方法（1）机械法（2）酶法第16页/共62页2、影响原生质体分离因素（1）材料来源（2）渗透压（3）酶（4）分离培养基（5）培养条件（6）组织前处理3、原生质体的收集、纯化和活力测定第17页/共62页（二）原生质体培养（三）细胞融合（体细胞杂交）1、融合方法（1）NaNO3处理诱发融合（2）高pH-高浓度钙离子处理（3）PEG处理（4）电融合2、融合方式第18页/共62页3、杂种细胞筛选（1）形态互补（2）遗传互补（3）代谢互补（4）生长互补4、杂种鉴定5、细胞融合与作物育种第19页/共62页第二节转基因技术与作物育种作物转基因育种：根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，在经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。第20页/共62页常规育种技术相比，转基因育种具有很大优势：

1.可以利用的基因资源大大拓宽。

2.为培育优良品种提供了崭新的育种途径。

3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择。

4.可以大大提高选择效率，加速育种进程。

第21页/共62页（一）作物的转基因技术1、转基因技术的发展现状（1）国际转基因植物研究与现状作物1996年1997年1997年/1996年大豆玉米烟草棉花油菜合计50301008012280510320160140120125010.210.71.61.8104.5全球转基因作物种植面积比较（单位：万公顷）第22页/共62页（2）我国转基因作物研究与利用概况转Bt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现第23页/共62页（二）转基因育种程序

目的基因或DNA的获取含有目的基因或者DNA的重组质粒的构建受体材料的选择和再生系统的建立转基因方法的确定和外源基因的转化转化体的筛选和鉴定转基因植株的育种利用第24页/共62页1、目的基因的获得（1）根据基因表达的产物---蛋白进行基因克隆分离和纯化控制目的性状的蛋白质或多态，进行氨基酸序列分析;根据所的氨基酸序列推导相应的核苷酸序列;采用化学合成的方法合成该基因;通过相应的功能鉴定来确定所推导的序列是否为目的基因。第25页/共62页（2）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因

A、同源序列法和表达序列标签法同源序列法是根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点发展的一条快捷克隆即因家族未知成员的新途径，即基于同源序列的候选基因法。表达序列标签是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的信息区，因而可以和其他基因相区分。目前，表达序列标签主要是通过cDNA的途径获得。第26页/共62页B、根据连锁图谱克隆的基因精确定位的大片段DNA文库连锁的分子标记筛选含目的基因的大片段DNA克隆含目的基因的精细物理图染色体步行分段制成探针cDNA文库目的基因亚克隆文库含目的基因的亚克隆序列分析及基因克隆目的基因的图位克隆方法示意图第27页/共62页C、转座子标签法纯合体突变株核基因库1带转座子DNA片断野生型植株核基因库2完整的目的基因互补测验检测功能转座子探针亚克隆片断做探针转座子标签法克隆重要农艺性状基因示意图第28页/共62页D、差异显示法在生物个体发育的不同阶段或是在不同的组织、空间进行有序表达的方式，叫做基因的差异表达。差异显示PCR是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带，该条代就有可能是全长或是部分特异表达的基因，利用这种方法进行基因克隆的方式就是差异显示法基因克隆。现在又出现了限制性消减杂交（SSH）和RNA任意引物PCR（RAD-PCR）等多种方法。第29页/共62页2、目的基因重组质粒的构建质粒重组的基本步骤：从原核生物中获取目的基因的载体并进行改造；利用限制性内切核酸酶将载体切开，并用连接酶把目的基因连接到载体上，获得DNA重组体。第30页/共62页第31页/共62页3、受体材料的选择（1）良好的植物基因转化系统应具有的条件：高校稳定的再生能力；受体材料要有较高的遗传能力；具有稳定的外植体来源；对筛选剂敏感。（2）常用受体材料的类型：愈伤组织再生系统直接分化再生系统原生质体再生系统胚状体再生系统生殖细胞再生系统第32页/共62页4、转基因方法的确定和外源基因的转化（1）.载体介导转移系统

将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体携带将外源基因导入植物细胞并整合在核染色体组中随着核染色体组一起复制和表达。

主要方法有：叶盘法真空渗入法原生质体共培养法第33页/共62页（2）.外源基因直接导入法这是一种不需要借助载体介导，直接利用理化因素进行外援遗传物质转移的方法。

主要方法有：化学刺激法基因枪轰击法(genegun)高压电穿孔法(electroporation)微注射法(microfibers)超声波介导法脉冲电泳法离子束介导法第34页/共62页5、转化体的筛选和鉴定

1.转化体的筛选

2.转化体的鉴定（1）DNA水平的鉴定（2）转录水平的鉴定（3）翻译水平的鉴定6、转化体的安全性评价和育种利用第35页/共62页二、转基因作物的遗传特点（一）、外源基因整合机制1、同源重组整合（homologousrecombination）外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生交换替代，并整合到受体染色体组上。2、位点特异性重组（site-specific

recombination）在两条DNA的特异位点上，通过位点特异性重组酶的作用对DNA进行特异性切割，实现外源基因的整合。第36页/共62页3、转座作用（transposition）通过体外重组将外源基因插入到转座子系统中，当携带有目的DNA片段的重组转座成分复制并整合插入到染色体其他区域时实现外源基因的整合。4、异常重组（illegimaterecombination）异常重组整合是外源基因整合到植物基因组的最常见方式。第37页/共62页（二）、整合后的外源基因在

植物体内的表现共抑制：向受体植物种导入一个与受体内某基因同源的基因，导入的基因及受体内与它同源的基因表达都可能减弱的现象。基因沉默：转基因植株由于外源基因的结构被破坏或者外源基因插入了染色体异染色质区域，出现外源基因序列不表达。第38页/共62页(三)、外源基因在后代中的遗传规律分离类型家系数百分率1各位点的整合（3:1）81522各位点的整合

不连锁（15:1）3221

连锁（3:1<,<15:1）963各位点的整合

不连锁（63:1）963各以上位点（≥255:1）53

例外（<3:1）2013合计156100第39页/共62页三、转基因作物品种的选育（一）、转基因作物育种目标的制定依据市场经济的需要和生产发展前景依据不同的自然环境、栽培条件落实具体性状目标要考虑品种的搭配要充分考虑转基因作物，尤其是外援目的基因对人类健康和环境安全的影响第40页/共62页（二）、转基因方法的确定及转基因植株的获得

（三）、转基因作物品种的选育

纯系育种回交育种杂交育种杂种品种第41页/共62页（四）转基因作物的生物安全性（1）转基因作物的环境安全性转基因作物演变为农田杂草的可能性基因漂流到近缘野生种的可能性对自然生物类的影响（2）转基因作物的食品安全性(foodsafety)有毒物质(potentialtoxicity)过敏源(allergenicityofnewlyintroducedproteins)changesinconcentrationsofkeynutrientsornaturaltoxicants.第42页/共62页第43页/共62页第三节、分子标记辅助选择育种一、分子标记的类型和作用原理1、分子标记的类型和特点类型（按技术特性分类）Hibridisation-basedmarkers以分子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP标记、DNA指纹技术、原位杂交）PCR-basedmarkers以PCR反应为核心德DNA指纹技术（RAPD标记、SSR标记、SSLP标记、SCAR标记、AFLP标记、STS标记）Sequencingbasedmarkers新型的分子标记（SNP标记、EST标记）

第44页/共62页2、原理和遗传特性(1)RFLP标记A.RFLP标记的原理

植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。第45页/共62页基本步骤DNA提取用DNA限制性内切酶消化凝胶电泳分离，转移到滤膜上Southern杂交

放射性自显影或酶学检测

第46页/共62页B、RFLP标记的特点

（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中第47页/共62页（2）RAPD标记A、RAPD标记原理B、RAPD标记的特点（3）AFLP标记A、AFLP标记原理B、AFLP标记的特点第48页/共62页（4）SSR标记A、SSR标记原理根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。第49页/共62页基本步骤设计探针，筛选重组克隆根据SSR两侧序列设计并合成引物

PCR扩增反应

建立基因组DNA的质粒文库对阳性克隆DNA插入序列测序凝胶电泳检测多态性第50页/共62页B、SSR标记的特点（1）SSR标记为共显性标记，可鉴别出纯合子和杂合子。（2）重复性高，稳定可靠。（3）DNA用量少，对DNA的质量要求也不太高。（4）使用SSR技术需要知道重复序列两翼的DNA序列。第51页/共62页二、重要农艺性状基因连锁

标记的筛选技术（一）、遗传图谱的构建与重要农业性状基因的标记1、遗传作图的原理其原理是基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置，并不反映DNA的实际长度。第52页/共62页2、构建遗传图谱的主要环节：根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体。对群体中不同植株的标记进行基因性分析。借助计算机程序构建连锁群3、构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。4、用于分子标记的遗传作图可分为两类：暂时性分离群体，包括F2群体、BC等

永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等第53页/共62页自花授粉作物作图群体的构建方法P1×P2F1F2F3F4F1B1:BC1F1×P1F1×P1F1×P1B2:BC2DHL异花授粉作物作图群体的构建方法ABCDEfGAbcdEfg×AbCDEfGaBCdefg杂合F1对B、D、G位点来说，相当于F2对A、C、E位点来说，相当于测交F位点不分离第54页/共62页F2BC1DHRIL群体形成F1自交后代F1回交后代F1花粉分化个体F2个体自交后代性状研究对象个体个体品系品系准确度低低高高必要的群体规模大大中中分离比例1:2:3或3:11:11:11:1不同作物群体的特点第55页/共62页（二）、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记（三）、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记（四）、数量性状基因的定位第56页/共62页三、作物MAS育种（一）、作物MAS育种须具备的条件

分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，主要是应用PCR技术。筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。第57页/共62页供体受体RRRrrr(1-P)22P(1-P)P2MRmrMRmr目标基因与DNA标记间的遗传距离位p亲本中DNA标记的带型F1杂种中DNA标记的带型在F2分离群体中分子标记类型即MM,Mm,mmMM类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率利用MAS的遗传基础（以RFLP为例）M—抗性标记R—抗性基因m—感病标