体细胞核移植

体细胞核移植第1页/共37页动物克隆体细胞核移植之第2页/共37页主要内容：概念简介发展历史体细胞核移植技术的步骤体细胞核移植技术的应用前景新闻趣事哺乳动物核移植存在的问题展望第3页/共37页一、简介动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。主要方法胚胎分割胚胎细胞核移植胚胎干细胞核移植胚胎嵌合

体细胞核移植第4页/共37页体细胞核移植概念：又称体细胞克隆，作为动物细胞工程技术的常用技术手段，即把体细胞移入去核卵母细胞中，使其重组并能发育为新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物个体。原理：由于体细胞高度分化，恢复全能性困难，体细胞核移植的原理即是细胞核的全能性。克隆动物：用核移植方法获得的动物称为克隆动物。第5页/共37页二、历史

第6页/共37页“多莉”的诞生

从一只成年母绵羊的乳腺中取出一个本身并没有繁殖功能的普通细胞，将这个细胞的基因分离出来备用；然后，再取出另一只母绵羊的未受精的卵细胞，将这个卵细胞的基因取出，换上第一只母绵羊乳腺细胞的基因，再将这个基因已被“调包”的卵细胞放电激活，使其开始像正常的受精卵那样进行细胞分裂；当细胞分裂进行一定连阶段、胚胎已经形成后，再将这个胚胎植到第三只母绵羊，经过正常的妊娠后产下“多莉”。第7页/共37页“多莉”的诞生掀起克隆研究热潮

1.1997年3月，即公布“多莉”培育成功后近1个月的时间里，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。

2.同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。第8页/共37页“多莉”的诞生掀起克隆研究热潮

3.1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多利”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多利”不同的、新的、相对简单且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”

4.1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。第9页/共37页

5.至1999年底，全世界已有6种类型细胞――胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管/子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。

6.2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多利”的技术完全不同，这表明中国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。“多莉”的诞生掀起克隆研究热潮第10页/共37页1、供体细胞的选择2、受体细胞的准备和去核3、体细胞核移植4、重构胚激活5、重构胚培养与移植三、体细胞核移植的操作步骤

第11页/共37页供体细胞的选择和处理在整个核移植体系中有着非常重大的意义，它不但影响重构胚的倍性、核的重编程、重构胚的发育，还决定着核移植胚胎发育的方向和命运。1、供体细胞的选择

第12页/共37页2、受体细胞的准备和去核用于核移植的受体细胞大体有三种，包括去除原核的合子、2-细胞期胚胎卵裂球和成熟卵母细胞。其中使用去核的MII期卵母细胞做受体是哺乳动物体细胞核移植中使用最多的。第13页/共37页其胞质中存在一类重要的蛋白因子，即成熟促进因子（MPF）维持着高水平的MPF活性细胞周期处于停滞状态，便于进行体外操作胞质环境接纳供体细胞的能力强为什么选择MII期的卵母细胞？第14页/共37页2、受体细胞的准备和去核受体细胞的去核是能否成功完成核移植的一个限制因素，也是影响核移植效率的另一重要环节。卵母细胞的去核常用方法：（1）盲吸法（2）DNA染色示踪去核法第15页/共37页3、体细胞核移植将供体细胞移植入受体细胞的方法主要有两种：（1）带下注射：是将供体细胞注射到卵周隙中，通过细胞融合使供体细胞核进入受体胞质中，这一方法注入供体细胞后必须保证细胞膜的完整性，才能使随后的融合成功。（2）胞质内注射：将供体细胞核或者供体细胞直接注射到卵母细胞质中的一种方法。第16页/共37页徒手克隆近年来，出现了不需显微操作仪的核移植方法即无透明带移植方法，也有称为“徒手克隆”的。其基本过程是在去核和融合前除去透明带，将胞质体－－供体细胞复合体进行电融合，构建重构胚。此技术耗材少，简单快速。用此技术已产出克隆牛，猪，羊第17页/共37页4、重构胚激活进核移植形成的重组胚虽然染色体恢复了二倍性，但其胞质还停滞在卵母细胞的MII期状态，想要使其重新进入细胞周期并启动其发育程序，必须通过一定的外界刺激。方法：（1）电激活法（2）化学激活法（3）精子提取物激活法第18页/共37页核移植重构胚一般要在体外培养一段时间后才移植到受体母体内。重组胚的体外培养系统一般都采用该物种体外受精胚胎的体外培养系统，但在同一培养条件下，重组胚的体外发育能力远远低于体外受精胚胎的发育能力。5、重构胚培养与移植第19页/共37页四、体细胞核移植技术的应用前景

1.加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；

利用核移植技术可以大规模地生产具有优良性状、理想性别，相同遗传背景的克隆动物。利用体细胞克隆技术，结合胚胎移植等已经非常成熟的生物技术，可以节约大量生产种牛的时间和费用，同时，完成对高产、优秀奶牛的扩群。第20页/共37页高产奶牛体细胞核移植第21页/共37页2.保护濒危物种，增加存活数量；

四、体细胞核移植技术的应用前景

1997年3月中国科学院动物研究所研究员陈大元提出了克隆大熊猫的设想。1999年，研究小组将大熊猫的体细胞植入去核后的兔卵细胞中，成功地培育出了大熊猫的早期胚胎。第22页/共37页3.克隆转基因动物，作为生物反应器，生产医用蛋白；四、体细胞核移植技术的应用前景

利用转基因技术将医药保健效应的基因导入牛或羊的体内在牛或羊的乳房内进行试验将含有基因的药通过动物乳汁挤出来供给人类食用转基因动物的乳腺生物反应器流程第23页/共37页4.克隆转基因动物可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植；四、体细胞核移植技术的应用前景

多数研究证实：某些哺乳动物（如牛、羊、兔等）的卵母细胞具有接受异种体细胞核的能力，异种体细胞核在这些动物的卵母细胞中可以发生去分化和重编程。通过基因工程的各种手段对动物的基因进行修饰。从而使转基因动物（猪）有可能作为人体异种移植的供体。再则。通过克隆技术有可能在体外培育出移植所需要的器官。诸如心脏、肾脏、肝脏等。第24页/共37页5、利用克隆动物做疾病模型，可使人们更好地追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病；四、体细胞核移植技术的应用前景

第25页/共37页6.人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官后，可用于组织器官的移植。四、体细胞核移植技术的应用前景

第26页/共37页五、新闻趣事科学家经过5年的不断试验，使用克隆技术成功培育出澳大利亚胃育溪蛙的胚胎。这种青蛙因在胃里孵化后代并通过嘴巴生子而闻名，因为栖息地的丧失和疾病等原因，在1983年被宣布灭绝。科学家利用体细胞核移植技术使其中一些卵细胞自然分裂、生长进入了胚胎早期阶段。虽然复活的胚胎仅存活了几天时间，但是这一创新技术让我们看到了复活灭绝物种的曙光。1、《侏罗纪公园》将成现实？2013年04月07日07:46来源：城市快报第27页/共37页五、新闻趣事但是，生物学家们表示，复活恐龙在短时间内是不可能的。现有研究认为，DNA能够保存的最长时间是680万年，超过这个时间DNA就会分解，而恐龙在上千万年前就已绝迹，所以，理论上我们已经无法提取到恐龙的DNA样本。退一步说，即便真能从血液中提取出部分DNA，用青蛙的DNA代替恐龙的DNA这样的技术在当下也是不可能的。第28页/共37页五、新闻趣事克隆技术已多次成功克隆试验室动物和各种牲畜。不过，科学家一直无法克服成功率较低这个障碍，成功培育哺乳动物的次数并不多。对猫、猪和老鼠进行超过2次到6次的重复克隆的尝试经常以失败告终。2、日本科学家25次克隆培育出581只老鼠

2013年03月15日

09:34

新浪科技微博

第29页/共37页为了防止这些潜在的破坏性变异，研究人员添加了一种天然形成的化学物质——曲古抑菌素。根据刊登在《细胞-干细胞》杂志上的研究发现，这种做法能够让克隆效率提高6倍。通过对整个克隆过程的每一个步骤进行改进，日本科学家得以在成功率不降低情况下对老鼠进行连续克隆。五、新闻趣事第30页/共37页近日，美国哈佛大学医学院的遗传学家乔治?丘奇表示，自己能够利用克隆技术“复活”早在3.3万年前就已灭绝的尼安德特人。面对人类克隆，你是否也这般乐观？3、科学观察室：克隆人，有点远

2013-02-0114:54

来源：光明网五、新闻趣事第31页/共37页五、新闻趣事丘奇之所以对自己的想法如此有信心，是因为他表示自己已经迈出了非常关键的一步，那就是从骨骼化石中提取到足够的能够再造尼安德特人这种已灭绝的人类种群的DNA，而且，他相信当前的DNA读写技术进步空前。不过，让他发愁的是，如何寻找一位富有冒险精神的女性来参与尼安德特人的代孕计划。第32页/共37页据台湾媒体报道,朱成志团队历时3年研发出手工卵子分切克隆技术,并利用该技术成功克隆出两胎花斑迷你猪,其中一只已成功繁衍后代,显示技术已成熟。朱成志表示,他们的新技术设备费用仅需约50万元(新台币,下同),而传统的体细胞核移植则需200至300万元。这将有利于推广至“田间地头”,再加其制造效率提高,可显著增加产值。五、新闻趣事4、台湾专家成功克隆全球首例“迷你猪”

2013年02月01日11:45:51来源：

新华每日电讯2版第33页/共37页据介绍，体细胞核移植技术以玻璃微吸管将受核卵子去核，以移除遗传物质（染色体），再将供核体细胞移入卵子透明带内融合。而手工卵子分切克隆技术是直接将卵母细胞分切为二，丢弃含有细胞核的一半，将留下的另一半与供核体细胞融合，接着再用另一批去核的卵子与其进行第二次融合。五、新闻趣事第34页/共37页克隆技术效率低；目前公认的体细胞克隆成功率在1%～3%。克隆胚胎移植后的出生率平均不到10%