第二章基因工程基本技术原理序列分析演示文稿

第二章基因工程基本技术原理序列分析演示文稿第一页，共二十七页。优选第二章基因工程基本技术原理序列分析第二页，共二十七页。2.5.1Sanger双脱氧链终止法■

2.5.2Maxam－Gilbert化学修饰法■

2.5.3序列分析自动化■2.5.4杂交测序■2.5.5DNA策序的商业运作及存在问题■2.5.6思考问题■第三页，共二十七页。2.5.1Sanger双脱氧链终止法60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实第一，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。返回DNA核酸序列分析历程第四页，共二十七页。引物—延伸测序策略1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．RayWu）独创性地设计出一种崭新的引物延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列；1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法；M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。第五页，共二十七页。2.5.1.1Sanger双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2’，3’双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。也称引物合成法，或酶催引物合成法。第六页，共二十七页。反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、一种ddNTP、以及四种dNTP（有一种带放射性标记）。变性胶电泳分离反应混合物。放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。第七页，共二十七页。GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTPddATPddGTPddTTPAGTCAGGATCACC考考你第八页，共二十七页。酶、原料比例dNTP／ddNTP=100：1时，谱带分离效果较佳，可读出多于200个以上的核苷酸顺序。降低dNTP对ddNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到能判读出300个左右的核苷酸顺序。第九页，共二十七页。2.5.1.2Sanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷分析：这样处理后，能策得高分子量DNA吗？为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。费时、费力、费钱、DNA损伤严重第十页，共二十七页。克服缺点的一种途径—DNA分子克隆将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链DNA噬菌体，例如M13作为载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物”。第十一页，共二十七页。M13载体克隆DNA片段将DNA片段克隆在M13mp载体特定LacZ区段中重组体噬菌体在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白色的噬菌斑;非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。第十二页，共二十七页。这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。第十三页，共二十七页。使用M13载体系列的优点所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样，就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种最普遍采用的快速的DNA序列分析法。第十四页，共二十七页。2.5.1.3Sanger双脱氧—pUC体系DNA序列分析法将待测DNA片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形的双链质粒DNA按双脱氧链终止法作DNA序列分析。这种方法特称为利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。由于通常使用的质粒多是pUC载体系列，所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列分析法。第十五页，共二十七页。Sanger双脱氧—pUC体系DNA序列分析法基本步骤待测DNA与pBR322或pUC分子重组；转化：转化反应物涂布在补加有Xgal-IPTG选择性培养基平板上，经37℃过夜培养；挑选白色菌落，制备质粒NA。碱变性处理，与引物一起退火，然后按双脱氧法作序列分析。优点：无需将DNA克隆到M13载体上，更为简单快速，现已被许多研究工作者采用。返回目录第十六页，共二十七页。2.5.2Maxam－Gilbert化学修饰法是1977年由美国哈佛大学的A．M．Maxam和W．Gilbert

发明的，所以又叫做Maxam－GilbertDNA序列分析法虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言，化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中仍被采用。第十七页，共二十七页。2.5.2.1Maxam－Gilbert化学修饰法的原理化学试剂处理末端标记DNA片段，碱基的特异性切割产生的DNA片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。第十八页，共二十七页。出发材料：局部消化的DNA分子群体中纯化出特定的末端带有放射性标记的DNA片段(双链或单链）关键：4种核苷酸碱基中，有1～2种发生特异性的化学切割仅应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要内容。第十九页，共二十七页。碱基特异的化学切割反应——肼（NH2·NH2）肼能够从C4或C6位置作用于T和C，并用C4-C5-C6环化形成一种新环;进一步作用释放出吡唑琳酮环，留下的N1－C2－N3片段则仍连在糖环上。在具有六氢吡啶的条件下，通过β-消除反应，2个磷酸分子从糖片段上释放出来，从而导致DNA链断裂。反应体系中加入lmol/L浓度的盐，肼同T的反应速率便会逐渐下降，以确保发生C特异的化学切割反应。根据这一特点区别C和C+T之间的降解产物。第二十页，共二十七页。碱基特异的化学切割反应——硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］在硫酸二甲酯的作用下，碱基环中的氮原子发生甲基化反应（G

N7和A

N3）。中性PH：甲基化导致配糖键水解，留下失去碱基的糖一磷酸骨架上的键。这种键十分微弱，易于使糖片段两翼的磷酸脱落，造成DNA断裂;碱性pH：采用六氢吡啶同DNA甲基化反应，而这种反应对甲基化的G是特异的。因此，DNA链的断裂只在G发生。第二十一页，共二十七页。2.5.2.2化学修饰法测序图解第二十二页，共二十七页。CT+CG+AATTATCAGGATGGCGACTTCGAG+AT+CC试试看你作对了吗？