微生物的实验室培养终

微生物的实验室培养终第一页，共三十四页，2022年，8月28日微生物的类群原生生物原核生物真菌病毒如酵母菌单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等微生物包含了除植物界和动物界以外的所有生物无细胞结构真核细胞细菌、蓝藻原核细胞第二页，共三十四页，2022年，8月28日专题2微生物的培养与应用课题1微生物的实验室培养第三页，共三十四页，2022年，8月28日课题1微生物的实验室培养微生物的实验室培养条件：（1）为培养的微生物提供合适的营养和环境条件（2）确保其他微生物无法混入研究和应用微生物的前提防止杂菌入侵，获得纯净的培养物第四页，共三十四页，2022年，8月28日一.培养基1．概念：人们按照微生物对

的不同需求，配制出的供其

的营养基质。（1）按物理性质来分：培养基可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。（2）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。（3）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。2.分类：营养物质生长繁殖第五页，共三十四页，2022年，8月28日加入青霉素的培养基:不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基:加入高浓度食盐的培养基:几种选择培养基举例：分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌

分离自养型微生物加入唯一碳源为纤维素的培养基分解纤维素的细菌分离金黄色葡萄球菌第六页，共三十四页，2022年，8月28日几种菌落及其形态第七页，共三十四页，2022年，8月28日几种菌落及其形态第八页，共三十四页，2022年，8月28日微生物需要的四大类营养要素物质是：3.培养基的构成1.碳源2.氮源3.无机盐4.水凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。①无机碳源：CO2；NaHCO3等②有机碳源：糖类、脂肪酸、蛋白质、花生粉饼、石油等⑴概念⑵来源：⑶不同微生物所利用的碳源不同：1.微生物的碳源异养型微生物的碳源为：含碳有机物（有机碳）自养型微生物的碳源为：含碳无机物（无机碳）第九页，共三十四页，2022年，8月28日①无机氮源：N2、铵盐、硝酸盐、NH3等②有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。2.微生物的氮源⑴概念：⑵来源：⑶固氮微生物所利用的氮源是：3.特殊要求培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(微生物生长不可缺少的微量有机物）如维生素、某些氨基酸、碱基)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。氮气第十页，共三十四页，2022年，8月28日例1、下列物质可作为培养硝化细菌碳源、氮源和能源的依次是

（

）A含碳无机物、氨、氨

B含碳无机物、氮、硝酸盐C含碳有机物、氨、光

D含碳有机物、硝酸盐、氨例2、要将土壤中的自生固氮菌（如原褐固氮菌）与其它细菌分离出来，应将它们接种到（

）A．加入指示剂的鉴别培养基

B．含有蛋白胨的固体培养基C．没有有机氮的选择培养基

D．营养要素全面的液体培养基练一练AC第十一页，共三十四页，2022年，8月28日牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类。的水溶性物质。牛肉膏为微生物提供碳源、氮源、磷酸盐和维生素.蛋白胨主要提供氮源和维生素。第十二页，共三十四页，2022年，8月28日1.无菌范围：①实验操作空间,操作者的手、衣着消毒.②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行.④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触.超净工作台二.无菌技术：防止外来杂菌的污染第十三页，共三十四页，2022年，8月28日耐高温需保持干燥的物品，160～170℃1～2小时接种环、接种针等金属用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒灭菌定义方法较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化因素，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂紫外线灼烧灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸或煤酚皂溶液等高压蒸汽灭菌培养基，100KPa、121℃、15～30min2.消毒与灭菌：第十四页，共三十四页，2022年，8月28日灼烧灭菌干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅第十五页，共三十四页，2022年，8月28日煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂（70%酒精等）紫外线针对不耐高温的液体接种室、超净工作台能耐高温的，需要保持干燥的物品灼烧法干热灭菌高压蒸汽灭菌接种工具（接种环等）吸管实验操作者的双手培养皿等玻璃器皿培养基1、消毒方法2、灭菌方法干热灭菌第十六页，共三十四页，2022年，8月28日1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手

答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考第十七页，共三十四页，2022年，8月28日1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g三.大肠杆菌的纯化培养：㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.计算：培养基用量依配方计算各成分的用量2.称量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，称取时？牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂→补水定容4.调pH、分装、封口：1mol／lNaoH调制微碱5.灭菌：6.倒平板：培养基、培养皿第十八页，共三十四页，2022年，8月28日?思考1①溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?

②加琼脂的目的是什么?可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差作为凝固剂第十九页，共三十四页，2022年，8月28日思考2

①在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？②培养皿能否用高压蒸汽灭菌？?在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；在取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌第二十页，共三十四页，2022年，8月28日倒平板约50℃防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基第二十一页，共三十四页，2022年，8月28日1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。第二十二页，共三十四页，2022年，8月28日3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第二十三页，共三十四页，2022年，8月28日（二）纯化大肠杆菌

微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。1.平板划线法

通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。第二十四页，共三十四页，2022年，8月28日将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_______在_______旁冷却接种环，并打开棉塞将试管口通过火焰.将已______的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划__________条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。.将试管通过火焰，并塞上棉塞火焰冷却三至五灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_______开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。末端烧红将平板_____放入培养箱中培养。

倒置第二十五页，共三十四页，2022年，8月28日划3个平板1个不划线（空白对照）第二十六页，共三十四页，2022年，8月28日问题讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第二十七页，共三十四页，2022年，8月28日2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第二十八页，共三十四页，2022年，8月28日

2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。第二十九页，共三十四页，2022年，8月28日系列稀释操作101102103104105106

(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。

(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。

(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。第三十页，共三十四页，2022年，8月28日涂布平板操作(1)将涂布器浸在盛有70％的酒精的烧杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表面。(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却8～10s。(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。第三十一页，共三十四页，2022年，8月28日b.涂布平板：不超过0.1ml各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照滴灼试涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍第三十二页，共三十四页，2022年，8月28日2.菌种培养：3.实验结果观察将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37