分子标记辅助选择课件

第五章分子标记遗传标记分子标记分子标记在家畜育种的应用近10年来，分子遗传学和分子生物学有了突飞猛进的发展，主要表现在：大量DNA水平上的分子遗传标记及其检测技术；DNA序列测定技术；转基因技术；核移植（体细胞克隆）技术；大量的分子标记提供的信息可用于：QTL的检测；标记辅助选择；标记辅助基因导入；标记辅助杂种优势利用；标记资源保存；研究品种起源与发展；亲子鉴定；等等。研究最多理想的标记应具备：

☆高多态性，多态是指标记在群体中有多种基因型，多态程度高，个体之间在标记上就能表现出差异，所提供的信息也就越多；

☆数量多，而且均匀地覆盖整个基因组；

☆对它的测定不受年龄、性别、环境等因素的限制；

☆共显性，能够准确判别所有可能的基因型。

传统的标记有：

1、形态学标记：主要指一些具有鲜明外部特征的质量性状，并可以通过表型来推断其基因型，如毛色、有无犄角等；

2、细胞学标记：是指染色体形态、数目和结构的变异，用具有异常染色体的个体与具有正常染色体的个体杂交或用染色体替换等手段，可对一些基因进行定位；

3、生化标记：是在血液或乳中的蛋白质（包括酶）的多态性，这些多态性可通过免疫反应或电泳技术反映出来，并由此判定其基因型，如血型抗原、血液蛋白、乳蛋白、同工酶等。

传统标记的主要缺陷：多态性和数量有限。第二节分子标记（molecularmarker）

Botstein限制性片段长度的多型性

RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)VNTR(variousnumberoftandemrepeats)1985K.B.Mullis基于聚合酶链式反应的多型性

PCR-basedpolymorphsm1996E.Lander单核苷酸多型性

SNP(singlenucleotidepolymorphism)分子标记具有明显的优越性：直接以DNA的形式表现，在各个组织、各发育时期均可检测，不受季节、环境限制，不存在是否表达的问题；数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限；多态性高，自然存在着许多等位变异，不需要专门创造特殊的遗传材料；表现为中性，即不影响目标形状的表达，与不良性状无必然的连锁；共显性。分子标记是传统遗传标记的补充和发展。RFLP

RestrictionFragmentLengthPolymorphisms限制性酶切片段长度多态性，是指用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，所得的含有同源序列的酶切片段在长度上所存在的差异。差异的产生是由于DNA序列中个别碱基的变异而造成某个限制性内切酶酶切位点的产生或丢失。最早开发的DNA标记。特点:无表型效应;共显性—双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现;种族特异性;标记范围遍及全基因组;但所需DNA量大,检测步骤繁琐,检测时间相对较长（一般需10-14天）,耗费成本高,需利用放射性同位素。

可将RFLP标记转化为PCR-RFLP标记CAPs又称PCR-RFLP即利用特定引物进行PCR扩增，将PCR产物用限制性内切酶酶切，检测酶切片段大小差异，观察其多态性。RAPDrandomlyamplifiedpolymorphicDNA---随机扩增多态性DNA是基于PCR技术的分子标记，它是用随机序列组成的寡核苷酸作为引物，通过专门的PCR反应扩增所获得的长度不同的多态性DNA片段。遵循孟德尔方式遗传；随机引物分子已成为商品，数量几乎无限；一次反应可检测1-10位点；以显性为主，不受环境影响，无上位性；成本低，DNA用量少，检测时间短（一般10小时），灵敏度高，重复性差。AFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphism----扩增片段长度多态性是指通过特定引物和DNA多聚酶链式反应复制并扩增不同个体基因组DNA模板后，所得扩增片段在长度上的差异。AFLP分析步骤:选用识别4碱基酶切位点的内切酶MseI和识别6碱基酶切位点的EcoRI（按概率计算，前者识别的酶切位点较后者多）共酶解总DNA；加入人工合成的并能与MseI，EcoRI两端点连接的接头分子，再加入分别与两端特异靶序列（包括两端接头序列，酶切位点序列以及在3’端延伸的3个随机碱基）互补的引物分子进行PCR扩增。由于不同试材酶切位点序列及其毗邻序列的突变，就会在PCR扩增中表现出M-E片段长度的多型性，即称为扩增片段长度的多态性（AFLP）。

特点用于AFLP分析的限制性内切酶与选择性碱基组合的数目和种类很多,AFLP可以产生的标记数目是无限的；AFLP的多态性高，一次PCR反应可以同时检测多个遗传位点；共显性；模板用量少，对模板浓度的变化不敏感；扩增的片段较短，分辨率高；利用特定引物扩增，退火温度高，假阳性低，可靠性高；扩增片段与基因组的单一位置相对应，可作为遗传图谱和物理图谱的位标；分析成本高VNTR（串联重复的数目变异）探针P1P3P2P45repeats6repeats7repeats8repeatsSSR（简单序列的重复）

(SimpleSequenceRepeats)随着基因组测序的发展密度增加，定位准确检测快速，重复性好

SSR标记将成为基因定位和MAS

的重要技术之一STSSequence-taggedSites－－序列标签位点基因组中长度为200－500bp，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列用PCR技术将其专一扩增出来。STS引物获得主要来自RFLP单拷贝的探针序列，微卫星序列，Alu因子，表达基因序列及人造酵母染色体或粘粒的插入末端序列。SNP（单核苷酸多型性）singlenucleotidepolymorphism

是指在单个核苷酸上的突变所引起的多态。SNP标记技术是九十年代末发展起来的第三代分子标记。采用SNP技术可将不同试材等位DNA分子区段间的任一点突变序列检测出来。由于这一技术要求的仪器设备昂贵，合成的探针数量大，成本高，目前难以广泛应用。基本原理是根据已知的某一DNA分子的核苷酸序列序列，以矩阵（array）方式在芯片(chips)上，依次点入合成的15（或20或25）个碱基的探针（每次移动一个碱基），并对每一探针在第7（或11或13）碱基分别替换成A,T,C,G，合成4个探针为一组，与被荧光标记的总DNA进行分子杂交。在被替换的碱基位点上，可被互补杂交的chip位点会显示出明显的荧光（图）。

单核苷酸多型性

SNP(singlenucleotidepolymorphism)总DNA（DNA片段）序列测定例：人线粒体DNA片段16569bp探针合成p15.7p20.11p25.13p15.7ATCCTGATCGGGTAGATCCTGTTCGGGTAGATCCTGCTCGGGTAGATCCTGGTCGGGTAG

DNA5’TGAACTGTATCCGACAT….3’Primer(p15.7)3’tgacatAggctgtagtgacatCggctgtagtgacatGggctgtagtgacatTggctgtagTGAACTGTATCCGACATACGT该样本DNA序列；ACTTGACATAGGCTGTATGAACTGTATCCGACATACGT该样本DNA序列；ACTTGACAT

G

GGCTGTAPyro-sequencingPCR-SSCPPCR－SSCP是基于PCR的单链构象多态性(single-strandedcomformationpolymorphism)分析技术。基本原理：经PCR扩增的DNA片段在变性剂（如甲酰胺）或低离子浓度下，经高温处理使之解链并保持在单链状态下，然后于一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，当DNA发生碱基置换突变（点突变）时，会造成单链构象不同，通过显色或显影在凝胶上显示出带型的差别，即多态性。与PCR－RFLP相比，PCR－SSCP可以检测所有的点突变，包括PCR－RFLP能够检测的酶切位点的突变。SSCP原理图解影响SSCP显示的因素PCR扩增的特异性要强。设计引物时要使引物能与DNA模板特异性结合，而且引物之间不能形成二聚体，引物内最好不要存在发夹结构，还要选择一个合适的退火温度。PCR扩增的产量要高。PCR扩增的片段不宜过长。一般以100－300bp为宜，此时SSCP检出率约为99％；但当DNA片段为300－450bp时，其检出率约为89％。20℃12.5℃5℃5℃电泳最能清楚的表现出差异SSCP结果分析只有一处点突变的情况下，正常个体和突变纯合个体在双链DNA完全变性时，应该只有两条电泳条带，突变杂合子有4条带；但大多由于变性不完全，因此在这些带的前方还有一条带是没有变性的双链DNA。杂合子有时只有3条带，第4条带在凝胶上常与第3条带聚在一起难以区分。实验过程中特别注意设置对照：包括上样缓冲液中不加变性剂，未经变性处理的PCR产物作为对照，和已知具有点突变的片段长度相似的DNA作为对照。野生型杂合型突变型PCR扩增,得到更多特异DNA片段变性中性聚丙烯酰胺凝胶电泳应用遗传图谱的构建数量性状位点定位分子标记辅助选择：通过与目标基因紧密连锁的分子标记判断目标基因的存在。遗传多样性评估系谱确证猪氟烷基因的早期选择氟烷－－麻醉剂氟烷敏感反应阳性猪在应激的条件下会导致恶性高热综合征（MHS）。应激时猪体温骤然升高至42－45℃，呼吸急促，心跳过速，肌肉僵直，后肢强直，肌体内水及电解质代谢紊乱，肌肉中乳酸大量聚积，严重时可引起代谢酸中毒或心力衰竭而骤然死亡。恶性高热综合征与兰尼定受体基因(ryr1)有关。由兰尼定受体基因突变造成的。兰尼定受体是骨骼肌细胞内肌浆网上控制钙离子（Ca2+

）进出肌纤维的通道，应激敏感猪的基因突变改变了兰尼定受体结构，影响了受体的正常功能，使通道关闭及泵的作用受到抑制。在刺激因子作用下入氟烷麻醉下造成钙离子的大量析出，引起电解质紊乱，出现肌肉强直，体温剧烈升高等恶性高热综合征，并且析出的钙离子激活过量的糖原酵解，使肌糖原酵解过程加速，引起肌肉pH的异常变化，导致劣质肉的发生。RYR1的PCR－RFLP分析RYR1的cDNAC1843T1843,使受体蛋白Arg615Cys615，导致限制性内切酶识别位点的改变，HhaI（GCGC）HgiAi（GTGCTC）。步骤：

1、采取猪的新鲜血液，提取DNA；2、利用特定的氟烷基因的引物，进行PCR扩增；3、限制性内切酶HhaI或CfoI（同裂酶）对PCR产物进行酶切；

4、结果分析。氟烷检测结果分析：出现一条带（659bp）,RYR1基因型

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