中药重金属检测

中药中重金属检测研究进展——重金属免疫检测技术PPT模板下载：/moban/行业PPT模板：/hangye/节日PPT模板：/jieri/PPT素材下载：/sucai/PPT背景图片：/beijing/PPT图表下载：/tubiao/优秀PPT下载：/xiazai/PPT教程：/powerpoint/Word教程：/word/Excel教程：/excel/资料下载：/ziliao/PPT课件下载：/kejian/范文下载：/fanwen/试卷下载：/shiti/教案下载：/jiaoan/

样品前处理重金属在实际样品中往往以化合物的形态存在，一般不能直接进行检测。检测前进行样品前处理来除去干扰因素，并使金属离子释放到液相检测环境中，以便后续检测。基本原则：尽量完整地保留被测组分使被测组分得到有效浓缩常用样品前处理方法湿式消解法干式消解法（灰化法）微波消解法硝酸硝酸-过氧化氢硝酸-高氯酸利用微波的穿透性和激活反应能力，在密封装置内，使样品温度迅速升高，加入一定量的酸溶液，使样品中有机物质分解。Cu、As、Cd、PbHg究竟选用哪种方法,主要是根据分析元素及样品基体的性质而定。重金属检测技术ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.常规检测技术新型检测技术

电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）

比色法

原子吸收光谱法（AAS）

原子荧光光谱法（AFS）

紫外分光光度法

高效液相色谱法（HPLC）

电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）

高效液相-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）

阳极溶出伏安技术（ASV）

免疫法检测技术重金属检测技术ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.常规检测技术新型检测技术

电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）

比色法

原子吸收光谱法（AAS）

原子荧光光谱法（AFS）

紫外分光光度法

高效液相色谱法（HPLC）

电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）

高效液相-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）

阳极溶出伏安技术（ASV）

免疫法检测技术《中国药典》2010年版一部中采用AAS或ICP-MS对甘草、丹参、黄芪、金银花、西洋参、白芍、阿胶及枸杞子这8种药材中的重金属量进行测定。

硫代乙酰胺法、砷斑法、银盐法操作简便准确度和选择性差紫外可见光分光光度法高效液相色谱法比色法重金属+试剂=显色→在紫外可见光下有吸收快速、简便、重现性好干扰多、选择性差多用于铅、汞测定痕量金属离子+有机试剂=稳定的有色络合物多元素同时测定络合试剂的选择有限原子荧光光谱法（AFS）检测限低于AAS线性范围宽干扰少操作简便灵敏度高应用元素有限原子吸收光谱法（AAS）火焰原子吸收分光光度法石墨炉原子吸收分光度法二者常配合使用，前者检测速度快，后者灵敏度高3.氢化物原子吸收法检测限低、干扰小，但需专门的氢化物发生器，可检测元素较少4.冷原子吸收法只用于含汞元素的测定电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）高频感应电流产生高温，将反应气加热、电离，利用元素发出的特征谱线进行测定灵敏度高，检测限低，精密度高，线性范围宽及抗干扰能力强

能将多种金属元素同时或顺序测定，测定速度快

适用于绝大部分金属元素的测定弥补了原子吸收法等不能同时测定多种元素的不足，在痕量元素分析中占有很大的优势应用较多的是用其检测各类中药材或中药复方中各重金属含量电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）利用电感耦合等离子体将样品汽化，使待测金属元素分离出来，再进行质谱测定综合ICP较高的离子化能力和MS的高分辨、高灵敏度及连续测定多种元素等的优点，只需一次处理样品，一次上机就可以同时给出测试结果，可与多种进样或分离技术联用更低的检出限，更宽的线性范围，更强的抗干扰能力，更高的精密度及分析速度，可以提供精确的同位素信息，是目前痕量分析领域最先进的方法其价格较为昂贵，应用最多的仍然是对中药重金属的含量测定高效液相-电感耦合等离子体质谱联用技术（HPLC-ICP-MS）中药中重金属检测大部分是测定中药样品中待测元素的总量，但仅依靠测定元素总量来评价毒理作用是片面的，关键是要分析元素的形态用HPLC将样品中各元素形态进行有效分离，再用ICP-MS进行测定融合HPLC高效分离及ICP-MS低检出限、宽线性范围、能跟踪多种元素及同位素信号等优点目前多用于中药中砷形态的分析和镉含量的测定免疫法检测技术一种辅助检测方法用于现场抽检，批量样品快速扫描等检验省时、省力、便于携带、易于操作、费用低廉，灵敏度高和选择性强重金属离子本身为小分子物质，不具备免疫原性和反应原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体金属离子带有电荷，能与生物分子发生不可逆反应导致动物中毒免疫原性：刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞的能力反应原性：与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的能力既有免疫原性，又有反应原性的物质称为完全抗原只有免疫原性，没有反应原性的物质称为半抗原只有设计金属离子成为完全抗原，才能制备出单克隆抗体，进而建立重金属离子的免疫检测方法前提工作选择适当的络合物跟重金属离子特异性结合，让其具有一定的空间结构，然后产生反应原性，进而能与相应抗体产生特异性结合；将结合了金属离子的化合物连接于载体蛋白上，产生免疫原性，便能制备出相应抗体重金属离子络合物载体蛋白反应原性（与抗体结合）免疫原性(产生抗体)关键：寻找合适的络合物，即双功能螯合剂目前常用的双功能螯合剂：乙二胺四乙酸（EDTA）二乙烯三胺五乙酸（DTPA）载体蛋白：血蓝蛋白（KLH）牛血清白蛋白（BSA）由于载体蛋白会刺激机体产针对其自身的抗体，为了减少干扰，筛选出重金属-螯合物特异性的抗体，需合成与其他载体蛋白（如卵清蛋白（OVA））偶联的复合物作为筛选用的检测抗原。Cu(II)-DTPA-BSA：免疫抗原，刺激机体产生抗体Cu(II)-DTPA-OVA：检测抗原，也成包被抗原，固定在板上，用于筛选检测重金属离子的免疫检测采用抗原抑制检测的方法，按照抗体的种类分类：

单克隆抗体免疫检测间接竞争性酶联免疫吸附检测(ELISA)一步法免疫检测KinExA免疫检测等

多克隆抗体免疫检测荧光偏振免疫检测(FPIA)胶体金快速免疫层析检测法(CGEIA)目前应用较多的是ELISA检测法。酶联免疫吸附法(ELISA)技术较为成熟样本前处理简单，便于大批量样本快速检测可以适应重金属残留含量的微、痕量分析直接法间接法竞争法……主要步骤1.单克隆抗体的制备2.单抗的鉴定3.Cu(II)间接竞争ELISA检测方法的建立4.间接竞争ELISA法与ICP-AES法的比较1.单克隆抗体的制备制备完全抗原：通过双功能螯合剂DTPA（p-SCN-Bn-DTPA）螯合Cu（Ⅱ），再分别与BSA、OVA偶联，制备免疫完全抗原和检测完全抗原动物免疫：BALB／c小鼠首次免疫：Cu（Ⅱ）-DTPA-BSA+等量弗氏完全佐剂间隔14d，Cu（Ⅱ）-DTPA-BSA+弗氏不完全佐剂融合前3d，Cu（Ⅱ）-DTPA-BSA，直接腹腔注射加强免疫。Cu(II)-DTPA-BSA：免疫抗原Cu(II)-DTPA-OVA：检测抗原，包被抗原细胞融合及筛选：免疫小鼠脾细胞+SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤细胞)筛选阳性杂交瘤细胞株（即可产生抗体，又可在体外无限繁殖，但效价低）腹水单抗的制备：注射阳性细胞株细胞，10d后根据小鼠生长状况采集腹水。离心取上清，得腹水单抗2.单抗的鉴定腹水效价的测定单抗亚型的鉴定单抗特异性的检测：间接竞争ELISA法。用Cu（Ⅱ）-DTPA-OVA包被酶标板加入DTPA（pH8.0），10μl／孔；加入不同浓度的金属离子Co（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Hg（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）、Mn（Ⅱ）、Mg（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Al（Ⅲ）、Ca（Ⅱ）、Cr（Ⅲ），80μl／孔；加入10μl单抗腹水计算交叉反应率（CR）3.Cu(II)间接竞争ELISA检测方法的建立最佳包被抗原（Cu(II)-DTPA-OVA）浓度及抗体工作浓度的确定用不同浓度的Cu(II)-DTPA-OVA作为包被抗原，加入梯度稀释的腹水单抗，测定A450

值。以抗体稀释倍数为横坐标，A450值为纵坐标，绘制曲线，选择斜率良好，A450值在1.0左右的抗原抗体浓度作为反应浓度。标准曲线的绘制及最低检测限的确定最佳抗原浓度包被酶标板，加入DTPA，10μl／孔加入不同浓度的Cu（Ⅱ）（0、10、50、125、250、500、2000和5000ng／ml），80μl／孔，混匀加入最佳工作浓度的腹水单抗，10μl／孔测定A450值。Cu(II)DTPAOVACu(II)DTPAOVACu(II)DTPAOVACu(II)DTPACu(II)DTPACu(II)DTPACu(II)Cu(II)DTPADTPAYYYYYY37℃孵育1h；洗涤3次Cu(II)DTPAOVACu(II)DTPAOVACu(II)DTPAOVAYYHRPTMB测定A450