牙膏对口腔硬组织安全评价的试验方法-编制说明

牙膏对口腔硬组织安全评价的试验方法（征求意见稿）编 制 说 明广州宝洁有限公司二〇一九年三月1一研究背景口腔护理产品，包括牙膏和漱口水等，是目前大众日常使用的自我口腔清洁的方式。在这些产品的生产工艺中，有时为了配方的稳定性或者活性物质的有效性而调节作为配方非常重要的因素 --配方的pH值。比如，临床应用中的局部涂氟操作，产品配方的pH值会明显的影响其防龋效果。过去数十年的研究发现，低pH值可以促进氟进入到口腔硬组织，从而提升防龋能力。目前市场已有的含酸化磷酸盐氟化物的漱口水（pH3-4）以及含有亚锡氟的牙膏（pH4.5-6）均有长期的安全使用记录，而其原理都是依据于上述发现。除此之外，有的产品因含有杀菌剂或者钙和磷等活性物质，这些配方要求必须低pH，否则，会经常出现因为高pH而导致的产品快速失活。因此，ISO标准关于口腔护理产品的pH已经不设下限，pH指标并不能准确的反映产品的安全性。虽然有大量的临床数据以及多年的市场经验证明低pH产品是安全的，但还是有些机构和组织会质疑pH值低于5.5的口腔护理产品的安全性，尤其目前随着大众与专家们对牙齿磨耗及牙齿酸蚀认识的提升，关于口腔硬组织对低 pH值的敏感性也越来越受关注，但因为安全评价方法的缺失而被大众错误认识低pH的安全性。随着新的研究手段的不断更新，国内外科研人员开发出越来越多的对低pH值更为直接的评价硬组织安全的体外测量手段。因此，建立一个具有科学性、易操作、可区分已知安全产品和已知不安全产品、与已有的标准有关联的、易于推广的的安全评价方法势在必行，具有重要的意义。通过阅读相关文献，与该领域的专家沟通合作，本研究确定采用循环法来测定低pH牙膏对口腔硬组织的安全性。主要研究内容包括：循环条件的优化，检测方法的评估等内容。二目的和意义在我国生产和销售的牙膏都参考执行国家标准 GB/T8372《牙膏》的要求，《牙膏》国标关于硬组织安全的指标依赖于 pH值的控制来实现，目前对于产品的要求是pH5.5-10，pH低于5.5的牙膏，产品责任方应提供按标准方法对口腔硬组织进行安全性评价的试验报告。2近年来，随时新技术的不断进步，国内外市场逐步出现一些 pH值相对较低的产品，并且有长期安全使用记录；与此同时，伴随着新的研究手段的不断更新，国内外科研人员开发出越来越多的低 pH值更为直接的评价硬组织安全的体外测量手段，如轮廓法、显微硬度法等。在此形式下，急于更新我国对于口腔护理产品的硬组织安全评价方法，尤其是对于低 pH产品的安全评估显得尤为重要。ISO11609:2017标准中采用的磨损值测试方法有放射性同位素实验对应的RDA/REA法和表面轮廓仪对应的RDA-PE/REA-PE的两种测试方法。其中RDA/REA法从提出到现在已有五六十年实践历史，方法成熟可靠是国际口腔行业公认的标准方法，至少有两家国外检测机构可以长期提供检测服务。ISO11609:2017标准还引入的表面轮廓仪的方法，也可以达到与RDA/REA方法同当的结果。本项目所采用的方法与ISO11609:2017标准采用的方法相同，不涉及专利问题。循环法是在国际业界公认的传统的脱矿再矿化测试方法上进行的改进，并在国际知名学术会议（2016IADR）上得到了专家的一致认可。三任务来源本标准是依据国家标准化管理委员会关于下达第四批推荐性国家标准计划的通知国标委发函〔2018〕83号，计划编号为20184493-T-607，项目名称“牙膏对口腔硬组织安全评价的试验方法”进行制定，主要起草单位：国家轻工业牙膏蜡制品质量监督检测中心、广州宝洁有限公司，计划完成时间 2020年。四主要工作过程（1）起草（草案、论证）阶段2014年9月，成立了标准项目研究小组；2014年12月-2015年1月，形成方法的研究方案；2015年4月，形成标准初稿，确定方法验证方案，进行方法验证；2015年12月，完成方法验证，提出循环法的修改方案并再次验证，进行方法学评估；2016年5月，完成方法的验证评估，形成标准草案（2）征求意见阶段32018年12月-2019年4月：形成标准的征求意见稿，提交标准正文、编制说明、验证报告，向技术委员会发布，公开征求委员意见。3）审查阶段？？？4）报批阶段？？？五标准编制原则和依据本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》的要求进行编写。六标准的主要内容本标准包括表面轮廓法和循环法，都适用于牙膏对口腔硬组织（牙本质和牙釉质）的安全评价。牙釉质部分：在牛牙釉质块上分别进行测试牙膏浆和对照牙膏浆的体外刷牙或循环浸泡实验，模拟正常人群的日常口腔清洁行为。测试完成后， 体外刷牙实验的釉质样本使用轮廓仪进行检测， 循环实验的釉质样本使用显微硬度仪进行检测，两种检测方法分别来评价釉质样本测试前后表面形貌或显微硬度改变，评估测试牙膏对牙釉质样本的磨损或脱矿影响。使用轮廓仪测量牙釉质相对磨损值的方法是ISO中的REA-PE方法。牙本质部分：与牙釉质部分相似，既可用表面轮廓法，也可用循环实验。在处理后的牛牙本质块上分别进行测试牙膏浆和对照牙膏浆的体外刷牙或循环浸泡实验，模拟正常人群的日常口腔清洁行为。测试完成后，体外刷牙实验的牙本质样本使用轮廓仪进行检测，循环实验的牙本质样本使用显微硬度仪进行检测，两种检测方法分别来评价样本测试前后牙本质样品表面形貌或显微硬度改变，评估测试牙膏对牙本质样本的磨损或脱矿影响。用轮廓仪测量牙本质相对磨损值的方法是ISO中的RDA-PE方法。6.1 表面轮廓法引用ISO11609:2017Determinationofrelativedentifriceabrasivityto4enamelanddentinebyasurfaceprofilemethod表(面轮廓仪测试牙膏对牙釉质和牙本质的磨损)。本方法是基于使用轮廓仪测定刷牙后的摩损深度。 本方法已确定等效于放射性示踪法，用于牙本质评估的方法被称为 RDA-PE（RelativeDentinAbrasion–ProfilometerEquivalent,相对牙本质磨损-轮廓等效法），用于牙釉质评估的方法被称为REA-PE(RelativeEnamelAbrasion–ProfilometerEquivalent)6.2 循环法 主要技术路线制备牙本质或者牙釉质样品→测量牙齿样品的表面显微硬度基础值并分组→配制牙膏浆→配制人工唾液→循环处理→测量牙齿样品的处理后表面显微硬度值→统计分析并评估安全性 循环模型的优化 循环模型的选择体外pH循环模型是研究脱矿再矿化经典的体外模型，过去数十年中有上千篇文献提到此模型，也是业界公认的研究脱矿再矿化的模型， 其结果与临床实验有一定的相关性，可以用体外 pH循环模型来预测临床结果。胡德瑜教授提供的体外pH循环模型及其结果充分说明此模型可以用于评价牙膏的安全性。但在三家实验室（宝洁，黑人，薇美姿）做验证实验时，大家的共识是体外pH循环模型操作起来程序复杂，需要耗费大量的人力以及时间。鉴于这个方法的主要目的为评估低pH牙膏的安全性，有别于单纯研究脱矿再矿化能力，因此胡德瑜教授与宝洁联合研究， 在保证实验灵敏性重复性科学性的基础上， 优化并简化循环过程，极大地提升了模型的操作性和可推广性。优化之后的循环模型如下所示：处理时间牙膏浆浸泡，(5mL/牙片)37度5分钟重复DIWater充分清洗此步骤6次5人工唾液浸泡，(5mL/牙片) 37度55分钟人工唾液浸泡，(5mL/牙片) 37度过夜在循环模型中，每次处理时牙膏浆的浸泡时间都是 5分钟，这远高于日常的刷牙时间（0-2分钟），因此在循环模型是放大了牙膏对口腔硬组织的作用，如果低pH牙膏对硬组织有损害，那么此损害作用也是被放大的。 实验对照的选择日常饮食中的碳水化合物会有部分残留在口腔，继而被细菌代谢产生酸导致龋齿的产生；日常饮食中的酸性食物及饮料会直接导致硬组织脱矿。在循环法中，选择水作为正对照，所有的测试产品不能劣于水，这是一个相对保守的对照，因为人们日常的健康饮食都会对牙齿造成一定的损伤，水是极端的存在。选择水作对照也说明了循环法的条件严苛。循环法的负对照是1%柠檬酸溶液。这里的1%柠檬酸浓度甚至低于日常饮食中的水果及果汁饮料。所有的测试产品必须显著优于1%柠檬酸才算安全，也从另一个角度说明了循环法的严苛。 实验底物的选择循环法中使用牛牙作为实验底物。 原因是人牙属于人体器官，来源少， 且禁止买卖，仅限于科学研究。有大量文献报道牛牙在组织成分及结构上与人牙相近，因此选择牛牙作为实验底物是具有科学性的。据文献报道及实验室数据证明， 牛牙的矿化程度和硬度是低于人牙的， 对pH的作用更敏感。因此在循环模型中用牛牙来代表人牙， 也是从底物的角度放大了低pH值牙膏对口腔硬组织的作用，从底物的角度表明了循环法的实验条件严苛。 检测方法的选择1表面显微硬度法（SurfaceMicrohardness,SMH ）硬度是牙釉质重要的物理性能之一。 SMH测量是目前测量釉质硬度的主要方法。显微硬度仪测试时探头垂直压向脱矿标本的自然表面并停留一定时间，使之产生永久性形变，通过显微镜测量压痕尺寸以确定牙体硬组织矿物含量。釉质的6显微硬度能反映釉质的矿物质含量 ,SMH的变化可反映釉质矿物质的获得和丢失。且SMH测定操作简便，无需破坏样本，已成为研究牙体硬组织的一个重要方法, 釉质显微硬度也成为研究龋病的重要指标之一。在循环法中，显微硬度可以准确地分辨出不同 pH值对牙本质和牙釉质的作用（图 1a,1b），操作既简便又科学，且重复性好，适合方法的普及与推广。故在循环法中推荐使用的是显微硬度法。72定量光激发荧光技术（Quantitativelight-inducedfluorescence ，QLF）QLF技术基础源于荧光技术，牙体组织的釉牙本质界在单色光的照射下能够被激发出不同光谱的荧光。因为脱矿釉质的晶体结构出现改变， 病损区釉质光线散射增多，阻碍外界光线到达病损区釉牙本质界以及釉牙本质界产生的荧光透过釉质到达牙齿表面，从而导致照射到釉牙本质界的荧光强度降低， 通过釉牙本质界激发出的绿色荧光量减少， 激发出的荧光通过脱矿釉质时散射量增多， 最终导致进入探测器的荧光减少。故正常釉质和早期脱矿釉质在诱导荧光强度方面存在着较大的差异。在QLF荧光照片中，正常的釉质区域表现为高亮度的黄绿色荧光，而包括龋损区在内的脱矿区域则表现为荧光减弱的暗区。 脱矿程度越明显，该区发出的荧光强度越弱。在实际操作中发现如果使用 QLF，涂抹指甲油暴露操作区很容易污染牙面，以及因为指甲油的存在导致的拍照后软件分析有误差， 并且QLF所得参数的敏感请不如表面显微硬度，对产品的区分度不如表面显微硬度 （表1，图2）。表1：表面显微硬度和QLF对相同产品的不同评判83Micro-CTMicro-CT是利用X线扫描成像原理， 对样品进行高分辨率非破坏性 3D成像的实验设备。Micro-CT因为无创，并能获得样本的三维信息，已作为测评牙齿和骨组织密度的一项常规实验手段。 同时作为一项检测釉质和本质脱矿和再矿化前后矿物质密度改变的新型检测方法， 在口腔硬组织研究中使用得也越来越多。其成像原理、基本结构和操作流程均与临床使用的 CT非常相似，但因其使用了聚焦射线，针对体外的小样本扫描，分辨率远远高于临床螺旋 CT。以本实验室用到的Micro-CTμ80为例，最高分辨率能达到 10μm。Micro-CT设备耗费较高，仪器体积大，不利于方法的推广。 若想得到高分辨率的图像，扫描时间很长，操作不易，上手困难。4扫描电镜（Scanningelectronmicroscope ，SEM）SEM广泛用于牙体硬组织表面结构的观察。扫描电镜下能观察出正常釉质呈规则紧密排列的釉柱外形，脱矿后增大的釉柱间隙以及釉柱中心晶体是否完好。SEM同样体积庞大，耗费耗时都很高，且数据是半定量的图片，不能定量。95横断显微放射照相技术（ Transversemicro-radiography ，TMR）近几十年来，许多学者的研究结果一致表明：TMR能够成功地定量测定矿物质的损失量与获得量以及矿物质的分布，是目前被广泛接受的定量研究脱矿再矿化的“金标准“，常用该方法来评估新的龋损诊断技术。其原理是将标本制备成需要的厚度（牙釉质切片的厚度约为80-120um，牙本质约为200um），测量牙片段对单色X射线的吸收量，与同时暴露的标准参考物对比，通过测量标本的吸光度，专用软件根据标本和梯形阶梯影像的灰度级可自动计算得到脱矿深度和脱矿量：脱矿深度是指从标本表面到脱矿底部的距离；脱矿量是指正常釉质光密度痕迹与脱矿釉质光密度痕迹整合的表面积。因为诸多文献表明TMR能够成功的定量测定矿物质的损失量与获得量并表征矿物质的分布，因此TMR是目前实用性最强、最被广泛接受的评估牙齿硬组织脱矿与再矿化的方法。但是做TMR需要将牙片切成薄片，因为牙齿硬度高，切片技术限制了TMR的推广。此外，TMR需要X射线仪，操作不便，可行性较低。统计方法基于实验设计及已有的数据，统计方法采用“非劣性检验”，即：测试产品不劣于正对照（DIWater）在95%置信水平下单边检验，其中最小有效差异参考正对照与负对照的平均表面显微硬度改变值的差异的一半。通过“非劣性检验”的分析， 目前市售的绝大部分产品都是检验合格的， 除了日本一款漱口水(表2)；还有目前市售的一些饮料，普通消费者认为健康的或者不会联想到损害牙齿的，其实在循环法中， 经过“非劣性检验”分析， 检验不合格（表3）。这与美国宝洁内部还未发表的原位实验结果吻合。因此，在严苛的实验条件下，通过严谨科学的统计分析，表明循环法及非劣性统计分析是可行的。表2：市售漱口水非劣性检验结果10表3：市售饮料的非劣性检验结果七方法实验室验证情况循环方法邀请了华西医学院胡德瑜教授实验室、 美国宝洁研发中心、北京宝洁研发中心、好来化工（中山）有限公司、广州薇美资实业有限公司进行了方法验证工作。ISO表面轮廓法循环方法邀请了第四军医大赵信义教授实验室、 北京宝洁研发中心、广州薇美资实业有限公