扩张床分离 吴慎剑

扩张床分离汇报人：吴慎剑

日期：2012.11.7扩张床吸附技术概述扩张床的吸附原理扩张床吸附基质及装置细胞及碎片对吸附剂性能的影响扩张床操作扩张床吸附存在的问题及前景一、概述它集过滤、浓缩和初步纯化于一步完成，减少了操作步骤，缩短了操作时间，能提高收率和降低成本。发酵液或培养液的体积大、黏度高，故处理难、费时多，常使目标蛋白质受到蛋白酶、糖苷酶的作用而被破坏。故第一步操作常常成为整个下游过程的制约步骤。扩张床吸附技术是一种集成化分离技术，即对已有的两种单元操作进行有效的组合，组成一种更有效的单元操作，以达到提高产品收率，缩短纯化步骤，降低纯化费用和投资成本的目的。细胞悬浮液具有以下的特点目标产物浓度普遍比较低；组分非常复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类和无机盐类等多种物质的混合物；产物易失活，性质不稳定，易被空气氧化、易受微生物污染、易被蛋白酶水解二、扩张床的吸附原理发酵液内含有大量的颗粒，这些颗粒要在进行层析前除去。目前除去固体颗粒最常用的方法是离心和过滤。离心和过滤工艺的缺点：1.步骤多，累积损失大；2.操作时间长，目标产物易失活；3.对微米以下的颗粒，特别是对细胞碎片很难有效除去；4.投入高速离心机和超滤设备，增加了生产成本。离心、过滤：步骤多，累积损失大，操作时间长，目标产物易失活，对微米以下的颗粒难除去，设备成本高。相当于一个平衡级，效率差空隙小，易造成堵塞，床层压降增大返混严重平推流，空隙率大，压降小，吸附剂利用率高平推流是理想状态下在流动方向上完全没有返混，而在垂直于流动方向的平面上达到最大程度的混合。

上图是全混釜、流化床、扩张床和固定床的操作模式的比较。其中全混釜上料液处于理想混合时，只相当于一个平衡级，其效率比固定床差。一般液固相分离主要采取固定床方式，料液流经装有层析介质的柱时在介质层中流动基本上呈平推流，返混小，柱效高。但当料液中含有固体颗粒时，由于介质问的空隙很小，颗粒滞留在介质间，造成堵塞，床层的压降增大，最终使吸附无法进行，所以采用这种层析方法之前必须对原料液进行固液分离。几个概念1.最低流化速度：料液自下向上运动，当达到某一速度时，床层开始扩展，称为最低流化速度2.终点沉降速度：床层继续随流速的增大而不断扩张，吸附剂间隙增大，悬浮颗粒能通过，吸附剂仍能保持不被带出的最大流速3.床层空隙率：扩张床高度与沉降高度之比。三、扩张床吸附基质特性要求吸附剂的尺寸和密度应保证其终端流速与料液中需除去的固形颗粒间有明显的差异；吸附剂必须有一定的粒径和密度分布，在扩张床中会形成稳定的分级，从而减小固液相问的返混；吸附剂应具有良好的孔道结构，不易被料液中的脂类、核酸和杂蛋白等生物物质污染；吸附剂应具有特异性吸附的配基，使吸附剂对目标产物具有较高的吸附容量；吸附剂应具有较高的化学稳定性和良好的机械强度，其中较高的化学稳定性可以保证吸附剂可以承受较苛刻的洗脱条件，而良好的机械强度可延长吸附剂的使用寿命；吸附剂应具有良好的传质性能，在较高的流速下，可以保持较高的吸附量。商品化的扩张床/流化床介质

介质名称直径/um密度/(g/mL)表观液体流速(cm/min)琼脂糖-石英100-3001.153.0琼脂糖-金属80-1651.34.3琼脂糖-不锈钢20-403.72.5琼脂糖-硅藻土200-4501.328.8琼脂糖-玻璃100-3001.3-1.513.3葡聚糖-二氧化硅100-3001.358.0纤维素-二氧化钛125-6001.210.8多孔玻璃130-2502.24.0(1)共混包埋法将增重微粒均匀分散在天然亲水性高分子溶液中，通过溶解、结晶、再生等手段得到多孔基质。琼脂糖和纤维素都存在明显的链聚集结晶区域，结晶再生时能形成稳定的多孔网络结构，并能将增重材料包埋其中。3.扩张床吸附基质的制备

如将含纤维素的黄原胶溶液与含微米级TiO2颗粒的水溶液共混，升温溶解，然后在甲醇溶液中再生，即得到混合型的基质，但由于机械强度不够，需要进行后交联反应增强基质的强度。由于基质是经过研磨后筛分而得，形状并不一致，这会影响扩张时的流体力学特性。另外，TiO2微粒随机分散在纤维素骨架的网络结构中，也会影响蛋白质分子的传质效果。(2)反相悬浮聚合法采用反相悬浮聚合法将亲水性的不锈钢、二氧化钛、二氧化锆等增重内核或微核包埋在亲水性的天然高分子骨架中。例如使用石蜡油作分散相、Span85作乳化剂，将不锈钢微珠分散在琼脂糖的水溶液中，控制搅拌速度以获得不同的琼脂糖厚度，逐步降温冷却可获得高密度核壳型基质。如果在水相中加入交联剂(如环氧氯丙烷)，则可实现反相悬浮交联，基质的强度进一步提高，而孔隙率并不受到明显的影响。(3)悬浮聚合法将增重用的亲水性不锈钢、二氧化钛等无机物进行表面改性处理，利用悬浮聚合将其包埋于高分子共聚物中。由于共聚的单体是有机亲油性的，而增重剂都是无机亲水性的，两者相溶性较差，聚合过程中易发生相分离，对增重剂有机化表面改性的效果直接决定了能否较大地提高颗粒的密度。(4)表面改性法1.化学改性：通过化学反应改变聚合物的物理、化学性质的方法。2.共聚物改性4.扩张床吸附装置基本结构与固定床一样上下分布器要求：分布器只能让流体垂直向上流过；剪应力控制在最小的范同内，以防止产物变性；细胞或细胞碎片不易滞留；方便清洗。吸附柱设计要求：减小液相返混程度5.细胞及碎片对吸附剂性能的影响及评价研究表明，若细胞或细胞碎片等生物颗粒吸附在介质上，将严重影响介质对目标物的吸附。下表列出了一些生物颗粒在不同吸附介质表面的吸附情况，可见主要是静电力在起作用。

在设计过程中，应该考虑把生物颗粒的影响引入到扩张床的过程设计中，在过程开发的早起就同时兼顾“目标物的吸附”和“生物颗粒顺吸附剂互相作用”，及时发现并排除生物颗粒的负面影响，确保扩张床吸附过程的顺利实施。生物颗粒Streamline扩张床吸附剂基质苯基阴离子阳离子强化阴离子染料亲和蛋白A亲和面包酵母一一一十十一一十十一一面包酵母匀浆液一一一十一一十十一一大肠杆菌一一一一一十一一大肠杆菌匀浆液一一十一一十一一一一葡萄球菌一一一十一一十十一一杂交瘤细胞一一十十十十十十一一十十十

一一生物颗粒在不同吸附剂表面的吸附亲和力种类：静电引力；疏水性作用。危害：1.使吸附剂发生聚集

2.破坏扩张床的稳定分级结构

3.削弱分离效果

4.床层的崩溃评价方法：生物颗粒静态吸附法、生物颗粒脉冲响应法和停留时间分布(RTD)分析法。①生物颗粒静态吸附法：②生物颗粒脉冲响应法。③RTD分析法。扩散系数——表示气体（或固体）扩散程度的物理量。扩散系数是指当浓度为一个单位时,单位时间内通过单位面积的气体量。6.扩张床操作平衡(equilibration)、吸附(adsorption)、冲洗(washing)、洗脱(elution)在位清洗(cleaninplace)1)平衡扩张床在首次吸附操作前须用平衡缓冲液扩张，逐渐增大流速，让扩张床扩张到一定程度，大约30min后达到平衡。扩张率过低，会造成料液中固体颗粒通过的困难；扩张率过高，会造成配基对目标产物的吸附效率下降。扩张床的吸附操作中最适宜的扩张率为2~3。流速300cm·h-1时，用缓冲液扩张到固定床高度两倍的扩张床吸附性能较好。扩张床内吸附剂的填充高度在10cm以上，可以消除进口区域不均匀流化的影响，得到稳定的床层和较低的返混程度。操作过程中，层析柱必须保持垂直，否则易发生不同层次之间的混合。2)吸附在吸附前，需先用平衡液将沉积的吸附剂流态化，建立一个稳定的床层。然后，将平衡液切换成原料液，由于原料液的黏度、密度和固体颗粒含量与平衡缓冲液不同，若维持原来的操作条件不变，床的扩张率会增大。为了保持一定的扩张率，起先需降低流速以保持床高；而在吸附操作的后期，由于介质吸附的蛋白质、细胞、核酸等生物物质，密度会有所增加，此时需要提高流速来维持原来的扩张率。在实际的吸附操作中，也可以采用维持流体流速，根据扩张高度的变化，调节扩张床内的高度调节器。3)冲洗目的：除去床层间滞留的细胞和细胞碎片；除去非结合或弱结合性的可溶杂蛋白。除去颗粒杂质冲洗时，流向与吸附时相同，采用的流体开始时大多使用平衡缓冲液。整个冲洗过程一般需要5～20倍沉降床体积的缓冲液。洗涤液的黏度或密度较低，会使床层不稳定。用25％甘油溶液洗涤，效果较好，由于其黏度和密度较大，洗涤液呈活塞流，能有效地将细胞颗粒洗出而对床层的稳定性无影响。流出液中观测不到固体杂质时可继续保持扩张床方式，也可改用固定床方式，因为采用扩张床流体速度限制在最小流化和夹带速度之间，固定床的低速不受限制，此时缓冲液流向取决于操作方式。注意调节上部速率分布器的位置比床层上界面高出0.5～1.0cm。4)洗脱固定床方式洗脱是缓冲液从扩张床顶泵入，以固定床方式向下洗脱；优点：减少洗脱缓冲液的用量，增加产物浓度，减少残留在床内的细胞对产物的污染，缺点：①洗脱时间比较长，洗脱操作复杂，需要调节高度调节器和反向进样；②操作时膨胀介质会产生聚集，影响其再度膨胀，造成在位清洗的困难；③床层压降高，对介质的机械强度要求高。扩张床方式洗脱是缓冲液从扩张床底部泵入，进行向上洗脱。优点：①洗脱方式简单，洗脱迅速；②可减少返压；③不会造成吸附剂颗粒的聚集，提高清洗效率；④洗脱设备简单；⑤可实现连续化生产。5)清洗包括吸附剂的再生(Regeneration)和扩张床的消毒(Sanitization)。再生是维持吸附剂的吸附能力和确保所有杂质都被清除的必要环节杂质的危害：降低介质的吸附容量，特别是反复使用的介质，严重时还会导致吸附剂的集聚，出现沟流，影响扩张床的混合特性小分子链霉素发酵液的不过滤直接用离子交换分离提取，其分离过程是链霉素发酵结束后仅先酸化后中和，而不过滤除去菌丝及固形物，直接从交换柱的下部，以表观流速115～146cm·h叫送入柱中进行吸附，含菌丝及固形物的残液从柱上部流}H，待穿透后切断进料，用清水逆洗，将滞留的菌体和固形物等杂质除净，然后用稀硫酸洗脱并分段收集洗出液送去精制，离子交换柱则用酸和碱再生。扩张床过程将固液分离、吸附、浓缩集成在一起，大大简化了操作步骤，并使链霉素的收率大幅度地提高6)扩张床吸附技术的应用

扩张床吸附技术已广泛应用于包涵体、胞内、围膜、胞外分泌；酵母菌、动物细胞、杂交瘤、昆虫细胞等表达的重组生物产品的纯化，亦被应用于动植物组织、果汁、动物乳汁以及其它一些微生物