常见病原菌的灭菌抑菌保藏原理及方法

常见病原菌的灭菌抑菌保藏原理及方法第一页，共三十八页，2022年，8月28日常见病原菌的灭菌、抑菌、保藏

原理及方法第二页，共三十八页，2022年，8月28日第三页，共三十八页，2022年，8月28日消毒灭菌

基本概念消毒（disinfection）：杀死物体上或环境中的病原微

生物,并不一定杀死细菌芽胞或非病原微生物的方法。

灭菌（sterilization）：杀死物体上所有微生物的方法(包括芽孢)。

第四页，共三十八页，2022年，8月28日一、消毒灭菌的方法常用的消毒和灭菌方法可分为：1）物理方法：热力灭菌法辐射杀菌法滤过除菌法干燥与低温抑菌法2）化学方法3）生物灭菌法第五页，共三十八页，2022年，8月28日热力灭菌

原理：破坏菌体蛋白质与核酸，使其肽链断裂，蛋白质变性凝固，核酸解链崩解,导致细菌死亡。

火焰灼烧干热灭菌法烘箱热空气灭菌LIH法高温灭菌巴氏消毒HTST法

常压下

煮沸消毒

间歇灭菌

湿热灭菌消毒法

常规加压灭菌加压

连续加压灭菌法

第六页，共三十八页，2022年，8月28日

种类：常用热力灭菌法种类方法效果用途干热焚烧用焚烧炉燃烧灭菌废弃污物、尸体烧灼火焰烧灼灭菌接种环，试管口干烤红外线干烤箱，热空气160-170ºC2h电磁波热效应灭菌灭菌玻璃器皿等耐高温的物品医疗器械湿热煮沸法100ºC，5-10分钟，沸水消毒饮水和食具高压蒸气灭菌法高压蒸气灭菌器103.4Kpa121.3ºC×15-20分钟灭菌耐高温耐湿物品第七页，共三十八页，2022年，8月28日辐射杀菌法

紫外线（ultravioletray,UV)

:260nm-266nm（最佳杀菌波长）

杀菌原理：使DNA上相邻的T碱基通过共价键结合成

二聚体，干扰DNA复制与转录，导致细菌死亡

特点：穿透力弱

适用范围：适于空气和物

体表面消毒第八页，共三十八页，2022年，8月28日滤过除菌法（filtration）机理：用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去, 以达到除菌目的器具：滤菌器（filter）适用物品：不耐高温物品（血清、毒素、抗生素）以及 空气等的除菌第九页，共三十八页，2022年，8月28日低温抑菌法在低温状态下真空抽去水分冷冻真空干燥法：用途：保存菌种干燥与第十页，共三十八页，2022年，8月28日（二）化学消毒灭菌法消毒剂杀菌机理：1.使菌体蛋白变性和凝固：酚、醇、酸硷、醛类，重金属盐类（高浓度）2.干扰细菌的酶系统（酶失活）：氧化剂、重金属盐类（低浓度） 3.损伤细菌细胞膜酚类（低浓度）、表面活性剂第十一页，共三十八页，2022年，8月28日杀菌或抑菌，并无绝对界限，常常不易区分。同一物质，浓度高时可杀菌，而浓度低时只能抑菌，作用时间长可杀菌，作用时间短则只能抑菌。另外，由于各种微生物性质的不同，同一物质对一种微生物具有杀菌作用，而对另一种微生物可能仅有抑菌作用。第十二页，共三十八页，2022年，8月28日抑菌采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。第十三页，共三十八页，2022年，8月28日防腐利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过制菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施第十四页，共三十八页，2022年，8月28日化疗指利用具有高度选择毒力，即对病原菌具高度毒力而对其宿主基本无毒的化学物质来抑制主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施第十五页，共三十八页，2022年，8月28日抑菌的方法1、低温2、缺氧3、干燥4、高渗5、高酸度6、高醇度7、加防腐剂第十六页，共三十八页，2022年，8月28日抑菌的原理1、低温：利用4℃以下的各种低温（0，-20，-70，-196℃等）保藏食物等2、缺氧：采用抽真空、冲氮或二氧化碳、加除氧剂等方法来有效防止食品和粮食等的霉腐、变质而达到保鲜的目的3、干燥：采用晒干、烘干或红外线干燥等方法对粮食、食品等进行干燥保藏在密封条件下，也用生石灰，无水氯化钙干燥第十七页，共三十八页，2022年，8月28日抑菌的原理4、高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施来保护食物，是在民间早就流传的有效防霉腐方法。5、高酸度：在我国具有悠久历史的泡菜，就是利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜蔬菜产生大量乳酸，借这种高酸度而达到抑制杂菌和防霉腐的目的。第十八页，共三十八页，2022年，8月28日6、高纯度：用白酒或黄酒保存食品，在我国有悠久传统，如醉蟹、醉麸、醉笋和黄泥螺等产品，都是特色风味食品。7、加防腐剂：有些食品、调味剂、饮料、果汁或工业器材中，可加入可加入适量的防腐剂或防霉剂来达到防霉腐的目的，如丙酸（0.32%）或乙二酸（0.32%）来做面包等的防腐剂。第十九页，共三十八页，2022年，8月28日化学因素1、表面消毒剂：随浓度递增相继出现制菌和杀菌作用，形成一个连续的作用谱2、磺胺类药物：抗代谢3、抗生素：在低浓度能抑制和干扰他种生物的生命活动第二十页，共三十八页，2022年，8月28日杀菌抑菌含义消毒剂对微生物的杀灭能力生物制剂抑制妨碍细菌生长繁殖及活性的能力作用时间杀菌时间可为2min、5min、10min、20min相同条件下作用时间越短，杀菌率越低，所以选择最短的作用时间来检测杀菌性能更具有代表性抑菌时间可为2min、5min、10min、20min相同条件下作用时间越长，杀菌率越低，所以选择最长的作用时间来检测抑菌性能更具有代表性第二十一页，共三十八页，2022年，8月28日残留消毒剂的去除方法不同中和剂法（化学中合法）稀释法（酸碱平衡法）评价标准杀菌率≥90%，产品有杀菌作用。抑菌率≥50%~90%，产品有抑菌作用，抑菌率≥90%产品有较强的抑菌作用杀菌抑菌第二十二页，共三十八页，2022年，8月28日菌种保藏基本原则1、保藏菌种时首先要选择它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等，并创造一个低温、干燥、缺氧、避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能较长时间维持其休眠状态。2、对于不产孢子的微生物，也要使其新陈代谢处于最低水平，又不会死亡，从而达到长期保藏的目的。第二十三页，共三十八页，2022年，8月28日常用菌种保藏方法1常用的简易保藏法：斜面传代保藏法、半固体穿刺保藏法（适用于细菌和酵母菌）、石蜡油封法2甘油保藏法3干燥保藏法4真空冷冻干燥保藏法5液氮超低温保藏法第二十四页，共三十八页，2022年，8月28日1简易保藏法基本原理：利用低温来抑制微生物生命活动。通常将在斜面或半固体培养基上生长良好时培养物直接放到2~10℃冰箱中保藏，当培养基营养物质消耗殆尽后再重新移植到新的培养基上，故又称定期移植保藏法或传代培养保藏法。第二十五页，共三十八页，2022年，8月28日1简易保藏法定期移植时间间隔：一般不产芽孢的细菌约2周至1个月；放线菌、酵母菌和丝状真菌4~6个月；石蜡油封法一般可保藏1年。优缺点：操作简单，可随时观察菌种生长状况，但较费时费力，因经常移植传代，微生物物易发生变异。第二十六页，共三十八页，2022年，8月28日1简易保藏法定期移植时间间隔：一般不产芽孢的细菌约2周至1个月；放线菌、酵母菌和丝状真菌4~6个月；石蜡油封法一般可保藏1年。优缺点：操作简单，可随时观察菌种生长状况，但较费时费力，因经常移植传代，微生物物易发生变异。第二十七页，共三十八页，2022年，8月28日1.1斜面传代保藏法贴标签：菌种菌株接种日期接种：对数生长期后期成熟的孢子培养：细菌—37℃，18~24h酵母—28~30℃

，36~60h放线菌和丝状真菌—28℃

，4~7d收藏：管口面塞用牛皮纸包扎，或用融化的固体石蜡封棉塞后置4冰箱保存。第二十八页，共三十八页，2022年，8月28日1.2半固体穿刺保藏法贴标签穿刺接种：将菌种直刺入直立柱中央培养：同传代保藏法收藏：待菌长好后，用浸有石蜡的无菌软木塞或橡皮塞代替面塞并塞紧，置4℃冰箱中保藏，保藏0.5~1年。第二十九页，共三十八页，2022年，8月28日1.3石蜡油封法石蜡油灭菌：将石蜡油装入三角瓶中，装量不超过总体积的1/3，塞上面塞，外包牛皮纸，加压蒸汽灭菌（121℃

，30min），连续灭菌2次。然后在40℃温箱中放置2周或置105~110℃烘箱中烘2h，除去石蜡油中的水分。培养加石蜡油：以无菌吸管吸石蜡油加至菌种管中，加入量以高出斜面顶端或直立柱培养基表面约1cm为宜。收藏：面塞外包牛皮纸或用无菌橡皮塞，把菌种管直立放置于4℃冰箱中。放线菌、霉菌及产芽孢细菌一般可保2年，酵母菌及不产芽孢细菌可保1年。第三十页，共三十八页，2022年，8月28日2甘油保藏法期长，保存期间取样测试方便，在基因工程中常用于保存含质粒的菌株，一般可保3~5年。保护剂：40%左右的甘油机理：适当浓度甘油中，少量甘油分子进入细胞，使菌种细胞在冷冻过程中缓解了其由于强烈脱水及胞内形成冰晶而引起的破坏。保藏温度：-20℃左右或-70℃特点:操作简单，保藏第三十一页，共三十八页，2022年，8月28日2甘油保藏法方法步骤：无菌甘油的制备：80%的甘油在121℃灭菌20min保藏培养物的制备：活化纯化性能检测制备菌种培养物保藏菌悬液的制备：液体法菌苔法-20℃保藏快速冷冻；乙醇-干冰液氮超低温保藏：-70℃一般细菌、酵母保存期为3~5年。第三十二页，共三十八页，2022年，8月28日3干燥保藏法基本原理：将微生物赖以生存的水分蒸发掉，使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而达到较长期保藏的目的。低温条件下，保藏期可达数年至十几年之久。砂土管保藏法、明胶片保藏法、硅胶保藏法、麸皮保藏法第三十三页，共三十八页，2022年，8月28日砂土管保藏法—产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌。方法：处理砂土装沙土管制备菌液加孢子液干燥收藏恢复培养明胶片保藏法—细菌制备菌悬液制备菌液制备蜡纸加菌液干燥收藏恢复培养3干燥保藏法第三十四页，共三十八页，2022年，8月28日硅胶保藏法—丝状真菌。方法：制备硅胶制备菌液加菌液干燥收藏恢复培养麸皮保藏法—产孢子的丝状真菌。制备麸皮培养基培养菌种干燥收藏恢复培养3干燥保藏法第三十五页，共三十八页，2022年，8月28日4冷冻真空干燥保藏法该法集中了菌种保藏中低温、缺氧、干燥和添加保护剂等多种有利条件，是微生物代谢处于相对静止状态。该法可同时用于细菌、放线菌、丝状真菌、（除少数不产孢子或只产生丝状体真菌外）、酵母菌及病毒的保藏。该方法保藏菌种范围广、保藏时