常见病原微生物的检测

常见病原微生物的检测第一页，共七十八页，2022年，8月28日

兔血浆制备:无菌采取兔心脏血,以1份灭菌的3.8%枸橼酸钠液抗凝剂加4份兔血的比例充分混匀,离心,吸取上清液即为原兔血浆,分装成1ml/支或0.5ml/支;另用灭菌生理盐水稀释兔血浆,制成4倍稀释血浆(以下简称为稀释兔血浆),分装同上,于-18℃以下冰冻保存,供试验

遗留问题第二页，共七十八页，2022年，8月28日2第一节炭疽杆菌（一）炭疽杆菌（Bacillusanthraci）属于需氧芽胞杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之一。（一）生物学性状1.菌体粗大，排列似竹节状，无鞭毛，无动力，革兰氏染色阳性，本菌在氧气充足，温度适宜（25～30℃）的条件下易形成芽胞。第三页，共七十八页，2022年，8月28日32.在活体或未经解剖的尸体内，则不能形成芽胞。芽胞呈椭圆形，位于菌体中央，其宽度小于菌体的宽度。3.形成荚膜是毒性特征。4.炭疽杆菌受低浓度青霉素作用，菌体可肿大形成园珠，称为“串珠反应”。这也是炭疽杆菌特有的反应。第四页，共七十八页，2022年，8月28日41.本菌专性需氧或兼性厌氧，在普通培养基中易繁殖。2.最适温度为37℃，最适pH为7.2～7.43.在琼脂平板培养24小时，粗糙菌落。菌落呈毛玻璃状，边缘不整齐，呈卷发状，有一个或数个小尾突起，这是本菌向外伸延繁殖所致。（二）培养特性第五页，共七十八页，2022年，8月28日54.在5～10%绵羊血液琼脂平板上，菌落周围无明显的溶血环，但培养较久后可出现轻度溶血。菌落有粘性，用接种针钩取可拉成丝，称为“拉丝”现象。5.在普通肉汤培养18～24小时，管底有絮状沉淀生长，无菌膜，菌液清亮。有毒株在碳酸氢钠平板，20%CO2培养下，形成粘液状菌落（有荚膜），而无毒株则为粗糙状。第六页，共七十八页，2022年，8月28日6（三）抵抗力繁殖体抵抗力不强，易被一般消毒剂杀灭，而芽胞抵抗力强，在干燥的室温环境中可存活数十年，在皮毛中可存活数年。牧场一旦被污染，芽胞可存活数年至数十年。煮沸10分钟或干热140℃3小时可将芽胞杀死。炭疽芽胞对碘特别敏感，对青霉素、链霉素、卡那霉素等高度敏感。第七页，共七十八页，2022年，8月28日7一）致病性人类主要通过工农业生产而感染。机体抵抗力降低时，接触污染物品可发生下列疾病：1．皮肤炭疽，最常见，多发生于屠宰或毛刷工人及饲养员。2．纵隔障炭疽，少见。由吸入病菌芽胞所致，多发生于皮毛工人，病死率高。病初似感冒，进而出现严重的支气管肺炎，可在2～3天内死于中毒性休克。二、致病性与免疫性第八页，共七十八页，2022年，8月28日83．肠炭疽，由食入病兽肉制品所致，以全身中毒症状为主，并有胃肠道溃疡、出血及毒血症，发病后2～3日内死亡。上述疾病若引起败血症时，可继发“炭疽性脑膜炎”。炭疽杆菌的致病性取决于荚膜和毒素的协同作用。第九页，共七十八页，2022年，8月28日9（二）免疫性注射炭疽外毒素中保护性抗原于机体，能形成抗毒素免疫，对受染炭疽有保护作用。但单纯的荚膜抗体对机体没有保护作用。病后可获较强的免疫力。第十页，共七十八页，2022年，8月28日10三、微生物学检查1.采集皮肤炭疽的脓液、渗出物，肠炭疽的粪便以及病人的的血液等送检，兽尸禁止解剖，可割取耳朵或舌尖一片送检。2.将标本直接涂片，沙黄荚膜染色镜检，观察形态及荚膜特征，可以初步帮助诊断。第十一页，共七十八页，2022年，8月28日113.确诊应进行血平板分离培养，37℃孵育12～15小时，钩取可疑菌落，进行青霉素串珠试验，噬菌体裂解试验，碳酸氢钠平板二氧化碳培养。荚膜肿胀试验和小白鼠致病力试验等与其他需氧芽胞杆菌进行鉴别确定。第十二页，共七十八页，2022年，8月28日12四、特异防治1.预防人类炭疽首先应防止家畜炭疽的发生。家畜炭疽感染消灭后，人类的传染源也随之消灭。2.目前我国使用的炭疽活疫菌，作皮上划痕接种，免疫力可维护半年至一年。青霉素是治疗炭疽的首选药物，对肠道及吸入性炭疽治疗困难，有条件的可用抗血清。第十三页，共七十八页，2022年，8月28日13五、检测方法1.环状沉淀反应2.噬菌体裂解实验3.荚膜荧光抗体检测4.质谱分析法第十四页，共七十八页，2022年，8月28日14第一节布鲁氏杆菌（二）本菌属初次分离培养时多呈小球杆状，毒力菌株有荚膜，经传代培养渐呈杆状，革兰氏染色阴性。我国流行的是羊、牛、猪布氏杆菌一、生物学性状1.形态染色第十五页，共七十八页，2022年，8月28日15本菌为严格需氧菌；牛布氏杆菌在初次分离时，需在5～10%CO2环境中才能生长，最适温度37℃，最适的pH6.6～7.1，营养要求高，生长时需硫胺素，烟草酸和生物素，泛酸钙等，实验室常用肝浸液培养基或改良厚氏培养基。此菌生缓慢，培养48小时后才出现透明的小菌落，鸡胚培养也能生长。

2.培养特性第十六页，共七十八页，2022年，8月28日16在自然界中抵抗力较强，在病畜的脏器和分泌物中，一般能存活4个月左右，在食品中约能生存2个月。对低温的抵抗力也强，对热和消毒剂抵抗力弱。对链霉素、氯霉素和四环素等均敏感。

3.抵抗力第十七页，共七十八页，2022年，8月28日17本菌侵入人体后，被吞噬细胞吞噬，由于本菌具有荚膜，能抵抗吞噬细胞的吞噬消毁，并能在该细胞内增殖。反复出现菌血症。由于内毒素的作用，病人出现发热、无力等中毒症状，血流中细菌逐步消失，体温也逐渐消退。细菌在细胞内繁殖至一定程度时，再次进入血流又出现菌血症，体温再次上升，反复呈波浪热型。二、致病性和免疫性第十八页，共七十八页，2022年，8月28日18

人感染布氏杆菌表现乏力，全身软弱，食欲不振，失眠，咳嗽，有白色痰，可听到肺部干鸣，多呈波浪热，也有稽留热、不规则热或不发热。盗汗或大汗，一个或多个关节发生无红肿热的疼痛，肌肉酸痛，由于关节和肌肉疼痛难忍，即使不发烧也不能劳动，成为能吃不能活懒汉，故该病又被称作"懒汉病"。

病灶发生在生殖器官，影响生育，严重者可引起死亡。三、主要症状第十九页，共七十八页，2022年，8月28日19

本菌传染性大，要注意防止实验室污染。（一）分离培养急性期采集血液，慢性期采取骨髓，接种于双相肝浸液培养基（一半斜面，一半液体）置37℃10%CO2环境中培养，每隔2天检查一次，如无细菌生长则摇荡培养基，使液体浸过斜面上，有细菌生长，可依鉴定项目确定是否为布氏杆菌。经一月培养无细菌生长，可报告阴性。

四、微生物学检验第二十页，共七十八页，2022年，8月28日20（二）血清学检查通常作凝集试验，判定凝集效价1：50可疑，1：100以上为阳性。效价增高4倍以上时，更有诊断价值。（三）酶联免疫吸附检测第二十一页，共七十八页，2022年，8月28日21（四）PCR检测此法敏感、特异、快速，实时荧光定量PCR已用于布氏杆菌特异性基因的检测，即在PCR反应体系中加荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个过程。通过标准曲线可进行定量。第二十二页，共七十八页，2022年，8月28日22第一节结核分枝杆菌（三）简介第二十三页，共七十八页，2022年，8月28日23（1）形态与染色一、生物学性状第二十四页，共七十八页，2022年，8月28日24（2）培养特性第二十五页，共七十八页，2022年，8月28日25第二十六页，共七十八页，2022年，8月28日26（3）生化反应第二十七页，共七十八页，2022年，8月28日27（4）抵抗力第二十八页，共七十八页，2022年，8月28日28（5）变异性第二十九页，共七十八页，2022年，8月28日29二、致病性第三十页，共七十八页，2022年，8月28日30（一）致病物质第三十一页，共七十八页，2022年，8月28日311.荚膜第三十二页，共七十八页，2022年，8月28日32①梭状因子④蜡质D③硫酸脑苷脂②磷脂2.脂质第三十三页，共七十八页，2022年，8月28日33第三十四页，共七十八页，2022年，8月28日343.蛋白质第三十五页，共七十八页，2022年，8月28日354.多糖质第三十六页，共七十八页，2022年，8月28日365.核酸第三十七页，共七十八页，2022年，8月28日37（二）所致疾病第三十八页，共七十八页，2022年，8月28日38三、检测方法检测方法：免疫学和细菌学检测⑴根据感染部位选择样品制作标本⑵分离培养⑶动物试验⑷快速诊断第三十九页，共七十八页，2022年，8月28日39是人类霍乱的病原体。引起肠道传染病。霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属于国际检疫甲类传染病。第一节霍乱弧菌（V.cholerae）（四）第四十页，共七十八页，2022年，8月28日40两个生物型：古典生物型（霍乱的病原体）和埃尔托生物型（副霍乱的病原体）第四十一页，共七十八页，2022年，8月28日41流行情况第四十二页，共七十八页，2022年，8月28日42一、生物学性状形态与染色

1.呈弧形或逗点状；排列成鱼群状2.革兰阴性；无芽孢，无荚膜3.有单鞭毛，运动活泼，呈穿梭样或流星样4.有菌毛第四十三页，共七十八页，2022年，8月28日43培养特性1.营养要求不高；2.兼性厌氧菌；3.生长繁殖温度范围广（18-37℃）；4.嗜碱---碱性蛋白胨(pH8.8-9.0):初次分离培养

TCBS平板：黄色菌落5.可在无盐环境中生长

第四十四页，共七十八页，2022年，8月28日44抵抗力1.对热、干燥、日光，化学消毒剂和酸均很敏感

2.耐低温，耐碱。

四怕：怕醋、怕煮、怕晒、怕药。

怕热不怕冷怕干不怕湿怕酸不怕碱怕咸不怕淡第四十五页，共七十八页，2022年，8月28日45毒

素

霍乱肠毒素(CT)：前噬菌体基因编码

小带联结毒素Zot增加肠黏膜通透性

副霍乱肠毒素Ace肠段积液侵袭力鞭

毛菌毛致病物质第四十六页，共七十八页，2022年，8月28日46CT的结构B亚单位：

与小肠粘膜上皮细胞GM1神经节苷脂受体结合；由1个A亚单位和5个B亚单位构成的多聚体，不耐热。（前噬菌体基因编码）1A+5B第四十七页，共七十八页，2022年，8月28日47霍乱典型临床特征患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”。并发症有血容量减少，

循环衰竭及肾功能衰竭，导致尿闭、电解质、酸碱平衡失调导致肌肉痉挛。

第四十八页，共七十八页，2022年，8月28日48免疫性感染后可获牢固免疫力；再感染少见局部黏膜免疫；抗菌抗体（O）；抗毒素抗体（B）

O1群与O139群不存在交叉免疫保护作用。第四十九页，共七十八页，2022年，8月28日49⑴微生物学检查a.采集样品b.镜检c.分离培养并生化反应和凝集反应⑵PCR检查⑶Southernblot检测检验方法第五十页，共七十八页，2022年，8月28日50第二节食物传播的病毒及其检验1.朊病毒2.禽流感病毒3.甲型肝炎病毒第五十一页，共七十八页，2022年，8月28日51一、朊病毒及其检验

朊病毒(prion)----传染性蛋白粒子/朊粒/朊毒体，是一种不同于细菌、病毒或类病毒的在分类上尚未定论的病原因子，其本质为由正常宿主细胞基因编码的、构象异常的蛋白质，称为朊蛋白(prionprotein,PrP)，目前尚未检出任何核酸成分，是人和动物的传染性海绵状脑病（TSEs)的病原体。

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（一）形态与结构

prion是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白，分子量为27～30×103，因此又称为PrP27～30。大小30-50nm，电镜下看不到病毒粒子，负染后看到聚集而成的棒状体，大小10-250nm×100-200nm。其能在宿主细胞内复制，无免疫性，不诱发抗体。

一、生物学特性第五十三页，共七十八页，2022年，8月28日531.细胞朊病毒蛋白(cellularPrP,PrPC)：具有42%的α-螺旋，3%的β折叠。存在于正常组织及感染动物的组织中，是正常基因的产物，通常情况下是无害的，对蛋白酶K敏感。2.骚扰型朊病毒蛋白(scrapieprionprotein,PrPsc)：α-螺旋占30%，β折叠高达43%，仅存在于感染动物的组织中，与致病和传染有关，对蛋白酶K有抗性。两种不同的分子构型第五十四页，共七十八页，2022年，8月28日54朊病毒颗粒对一些理化因子的抵抗力之强，大大高于已知各类微生物和寄生虫。

1.传染源：感染朊毒体的人和动物。2.传染途径：消化道传播。医源性传播：脑外科手术、器官移植等遗传。（二）抵抗力

（三）致病性第五十五页，共七十八页，2022年，8月28日55疯牛病：牛海绵状脑病。病牛临床表现为步态不稳、共济失调、搔痒、烦躁不安等神经症状。绵羊痒病：它是羊的一种慢性致死性疾病，病羊具有中枢神经系统变性、剧痒、共济失调、高死亡率等特点。克-雅氏病：人的一种中枢神经系统变性疾病。其临床症状和病理组织学变化与疯牛病、绵羊痒病十分相似。

3.导致疾病第五十六页，共七十八页，2022年，8月28日56共同特征：潜伏期长（可达数年至数十年），一旦发病即呈慢性进行性发展，最终死亡。

第五十七页，共七十八页，2022年，8月28日57PrPC转变为PrPSC是疾病发生的基本条件，PrPSC在中枢神经系统细胞内聚集，导致神经元的破坏。脑组织病理学特点：中枢神经细胞空泡化、弥漫性神经细胞缺失、胶质细胞增生、淀粉样斑块形成、脑组织海绵状改变；PrPSc聚集。

4.发病机理

第五十八页，共七十八页，2022年，8月28日58

1.免疫组化技术

取可疑患者的脑组织或非神经组织切片，经脱水性或水解性高压消毒、甲酸和硫氰酸胍处理，使其感染性消失并破坏PrPC后，再用单克隆抗体检测对上述处理有抗性的PrPSC。

朊病毒的检验

第五十九页，共七十八页，2022年，8月28日59组织印迹法检测PrPSC是一种简单而敏感的诊断方法。方法：首先将待测的样品印迹在固相载体——硝酸纤维素膜上，用病毒的家兔特异性抗体（IgG）与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与酶标记的羊抗兔第二抗体进行反应，最后用酶的反应底物进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。

2.免疫印迹技术第六十页，共七十八页，2022年，8月28日60

从病人外周血白细胞中提取DNA，对20号染色体prion基因进行分子遗传学分析。3.基因分析第六十一页，共七十八页，2022年，8月28日61第一节禽流感病毒（二）禽流感是禽流行性感冒（Avian

Influenza，AI）的简称，这是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征，被国际兽疫局定为Ａ类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。

第六十二页，共七十八页，2022年，8月28日621.形态学特点禽流感病毒是正粘病毒，流感病毒属的一个成员。禽流感病毒具有A型抗原，属于A型流感病毒，列为禽流感病毒类。一、生物学特性

第六十三页，共七十八页，2022年，8月28日63流感病毒分为三个不同的抗原型，即A、B、C三型。其中B、C两型仅能对人致病，A型可对人、猪、马和禽致病。依据病毒表面的两种糖蛋白血凝素〈HA〉和神经氨酸酶〈NA〉可将A型流感病毒分成若干亚型。目前已有15种HA（H1-H15)和9种NA(N1-N9)。2.禽流感病毒的分型第六十四页，共七十八页，2022年，8月28日64对热的抵抗力较低，65℃30分钟，100℃2分钟即灭活，普通消毒剂能很快将它杀死。低温冻干或甘油保存可使病毒存活多年。

3.抵抗力第六十五页，共七十八页，2022年，8月28日65禽流感在家禽中以鸡和火鸡及某些野禽的易感性最高，并呈急性致死性传染病。鸭、鹅及其它水禽类的易感性较差，多为隐性感染或带毒，有时也能大批死亡。鸽子可带毒，但很少自然发病。4.流行病学第六十六页，共七十八页，2022年，8月28日66禽流感的症状极为复杂，有最急性、急性、亚急性及隐性感染等。℃，精神沉郁、拒食、病鸡很快陷于昏睡状态，有些颈部出现向后扭转的神经症状。病鸡多呈急性死亡，有的也可能出现呼吸道症状，咳嗽、打喷嚏，气管出现咯音，流泪等症状，羽毛蓬松，产蛋率下降，死亡率高低不等。5.临床症状和病理变化第六十七页，共七十八页，2022年，8月28日67

1.病原的分离病原的分离和鉴定可以从活体或尸体分离病毒。用棉拭子法常可从活体的气管和泄殖腔中分离到病毒，可用不同大小的棉拭子擦取气管或泄殖腔，然后将拭子放入灭菌的保存液〈25－50%甘油盐水、肉汤或1000u/ml青霉素和10mg/mL链霉素的细胞维持液〉中。病料的采取时间：一般在感染初期或发病急性期采取。如转为后期则因机体已形成足够的抗体而不易分离到病毒.二、诊断第六十八页，共七十八页，2022年，8月28日68通常用鸡胚来进行。接种9-10日龄鸡胚尿囊腔，继续孵育48-72h。如材料中含有病毒时，则接种48h鸡胚死亡，但在多数情况下初代分离时鸡胚多不死，为此需将经72h未死的鸡胚置冰箱内冻死后，收集尿囊液作第二代接种。如第二代接种的鸡胚仍不死亡，即可判定分离病毒为阴性。2.病毒分离第六十九页，共七十八页，2022年，8月28日69三、介绍高致病性禽流感的其他知识鉴定高致病性禽流感的标准:

按照国际标准，能引起接种鸡死亡75％以上的分离株，是高致病性毒株。尽管接种鸡是确定致病的“黄金标准”，但它不能反应致死率小于75%的H5或H7亚型病毒的潜在致病力。因此0IE(国际兽疫局〉根据科学家的建议，推出新鉴定标准。

第七十页，共七十八页，2022年，8月28日70

1.任何分离到A型流感病毒，用0.2mL1:10稀释的无菌尿囊液静脉或肌肉注射8只4－8周龄易感鸡，10天内的死亡率不低于75%。

第七十一页，共七十八页，2022年，8月28日712.对所有低致病的H5、H7毒株，血凝素切割位点的氨基酸序列与高致病性禽流感病毒一致。

3.H5、H7以外的A型流感病毒，可以致死1－5只鸡，在缺乏胰蛋白酶的情况下,能在细胞上生长形成蚀斑。

第七十二页，共七十八页，2022年，8月28日72禽流感的传播途径是什么？禽流感的传播：有病禽和健康禽直接接触；病毒污染物间接接触。禽流感病毒存在于病禽和感染禽的