第三章微生物生态学基本研究方法

第三章：微生物生态学的基本研究方法2023/2/51参考书陈声明，林海萍，张立钦主编，微生物生态学导论，高等教育出版社，2007池振明主编，2005，现代微生物生态学，科学出版社杨家新主编，2004，微生物生态学，化学工业出版社宋福强主编，2008，化学工业出版社张素琴著：2005，科学出版社MolecularMicrobialEcology,

A.MarkOsborn&CindyJ.Smith,

Taylor&FrancisGroup,20052023/2/522023/2/53专业期刊MicrobialEcologyAppliedandenvironmentalmicrobiologyAdvancesinmicrobialecologyISMEJournalAppliedMicrobiologyandBiotechnologyFEMSMicrobiologyEcologyFrontiersinMicrobiologyGeomicrobiologyJournalNatureMicrobiologyReview2023/2/54你们能够想到什么方法开展微生物生态学的研究？微生物生态学？研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门学科关注的内容：主要研究微生物的分布、种群组成、数量和活力等与环境的关系，以及微生物之间、微生物与高等有机体之间的相互关系。2023/2/551、经典技术和方法直接观察测定培养研究2、生理生化方法3、分子生物学方法4、稳定同位素方法2023/2/561、经典技术和方法——直接观察测定利用显微镜对样品中的微生物直接观察计算数目，测定丝状微生物长度（普通染色、荧光染色）优点：直接观察天然样品中微生物的形态和微生物所处的位置缺点：样品量少，代表性差2023/2/57HepG2CellsStainedUsingtheLIVE/DEAD®CellImagingKit,showinggreen-fluorescentlivecellsandred-fluorescentdead

cells.HeLacellsshowingnegativestainingbyICC/IFusingonlysecondaryantibody.Thecellswere100%methanolfixed(5min)andthenincubatedin1%BSA/10%normalgoatserum/0.3Mglycinein0.1%PBS-Tweenfor1htopermeabilisethecellsandblocknon-specificprotein-proteininteractions.Thesecondaryantibody(red)wasab150091AlexaFluor®647goatanti-rabbitIgG(Fc)usedat2µg/mlfor1h.DAPIwasusedtostainthecellnuclei(blue)ataconcentrationof1.43µM.2023/2/582023/2/59Archaeainthepictureinred,sulfatereducingBacteriaingreen.Credit:AnneliePernthaler/UFZFISH技术2023/2/5101、经典技术和方法——培养研究对采集的样品进行稀释、培养辨认培养物的种类2023/2/5112023/2/512（1）基内菌丝与培养基结合紧密，不易挑起；（2）菌落边缘有辐射的菌丝，称为辐射状菌丝；（3）生长后期表面形成紧密的绒毛状或坚实、干燥、不透明、多皱的表面，上面常有一层色彩鲜艳的干粉；（4）可形成絮状或颗粒状的典型菌落，菌落的正反面颜色往往不一致，菌落边缘培养基的平面有变形现象；（5）有特殊气味（土霉气味）等。2023/2/5132023/2/5142023/2/515细菌菌落2023/2/5161、经典技术和方法——培养研究优点：能对活的微生物进行计数，并能区分真菌、放线菌和细菌缺点：可培养率很低<1%;单菌落是否由一个细菌繁殖而来；丝状微生物菌落究竟是由孢子而来还是由菌丝而来难以区分2023/2/517经典的观察和培养方法能够在一定程度上告诉我们样品中微生物的数量、可培养微生物的数量及类型。但这些结果不能告诉我们微生物在样品中能干什么？2023/2/518包括用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸方法、底物诱导呼吸法和光合微生物色素法等；用于测定土壤C矿化速率和微生物呼吸强度等方法；用于测定土壤中物质转化的生物活性和酶活性的分析方法；测定微生物能量代谢的分析方法等2、生理生化方法2023/2/519代谢活力研究：放射性/稳定同位素标记记某种代谢物，测定代谢活力C14，C13，H3，N15酶活性测定ATP含量测定：ATP仅存在于活的细胞中，且在细胞中的含量基本一致ATP检测仪2023/2/520代谢活力研究叶绿素含量测定：估计藻类和光合细菌的生物量和代谢活力土壤呼吸速率测定：间接估计土壤中的生物量，不适于仅有厌氧呼吸或发酵的微生物测定土壤呼吸测定仪2023/2/521代谢活力研究优点：能确定样品中微生物能做什么；缺点：无法说明样品究竟是哪些微生物在起作用，样品存在哪些微生物种类和微生物在自然样品中的分布情况2023/2/522Biolog微平板法PLFA图谱分析2023/2/523Biolog微生物自动分析系统是美国Biolog公司从1989年开始推出的一套微生物鉴定系统，最早进入商品化应用的是G-好氧细菌鉴定数据库(GN),其后陆续推出G+好氧细菌(GP)、酵母菌(YT)、厌氧细菌(AN)和丝状真菌(FF)鉴定数据库。Biolog系统6101版数据库共包括1973种微生物，其中细菌234个属，1226个种，与其他鉴定系统相比，其微生物种类的数据量较大，适合于环境、食品、工业、临床和动植物病原菌的鉴定分析。BIOLOG微平板法2023/2/524Biolog自动微生物分析系统主要根据细菌对糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等95种碳源的利用情况进行鉴定。细菌利用碳源进行呼吸时,会将四唑类氧化还原染色剂(TV)

从无色还原成紫色，从而在鉴定微平板上形成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱”。通过纤维光学读取设备——读数仪来读取颜色变化,由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或“指纹图谱”与数据库相比较，将目标菌株与数据库相关菌株的特征数据进行比对，获得最大限度的匹配,可以在瞬间得到鉴定结果，确定所分析的菌株的属名或种名。2023/2/525BIOLOGECO微平板含3组相同的碳源，根据平均颜色变化情况，计算微生物群落的多样性指数、代谢特征的变化等。2023/2/5262023/2/527四氯唑染料96孔微孔板2023/2/528培养时间(h)浅层含水层沉积物中微生物群落培养过程中AWCD的变化2023/2/529赵锐等，20102023/2/530赵锐等，20102023/2/531赵锐等，20102023/2/532磷脂类化合物只存在于细胞膜中，不同微生物其磷脂脂肪酸组成和含量都不相同。一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化合物马上降解。因此该方法十分适合于微生物群落的动态监测。PLFA图谱分析2023/2/533细胞膜磷脂双分子层2023/2/534毛细管柱2023/2/535TypicalGC-FIDsignalofextractedPLFAsunder(a)landfillgasddition(W+LG)and(b)thecontroltreatment(W,greycolourintheenlargement)in20cmsoildepth.(1)i14:0,(2)14:0,(3)i15:0,(4)a15:0,(5)15:0,(6)i16:0,(7)16:1o8c,(8)16:1o7c,(9)16:1o6c,(10)16:1o5c,(11)16:0,(12)10Me16:0,(13)i17:0,(14)a17:0,(15)17:1o8c,(16)cy17:0,(17)17:0,(18)10Me17:0,(19)18:2o6,9,(20)18:1o9c,(21)18:1o8c,(22)18:1o7c,(23)18:0,(24)cy19:0,(IS)internalstandard19:0.Watzingeretal.,2008,SoilBiology&Biochemistry40(2008)751–7622023/2/5363、分子生物学2023/2/5373、分子生物学方法(G+C)摩尔百分含量核酸探针杂交技术DNA-DNA杂交DNA序列分析基因芯片宏基因组学基于PCR的指纹图谱分析2023/2/5382023/2/539周继中Oklahoma2023/2/5403、分子生物学方法基于PCR的指纹图谱分析DGGE/TGGE单链构象多态性分析（SSCP）技术RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技术限制性片段多态性（RFLP:restrictionfragmentlengthpolymorphism）/扩增性cDNA限制性酶切片段分析（ARDRA:amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis）末端限制性片段长度多态性（T-RFLP)核糖体基因间隔序列分析（RISA:ribosomalintergenicspaceranalysis）/自动核糖体基因间隔序列分析（ARISA）扩增片段长度多态性（AFLP）高度重复序列或微卫星区域2023/2/5412023/2/542稳定性同位素探针(stableisotopeprobing,简称SIP)要先将标记的底物13C(或15N)添加到系统中,然后再提取微生物群落DNA，用梯度离心法把重的DNA(被13C或15N标记)和轻的DNA(未被13C或15N标记)分开。用群落DNA分析方法分别对重DNA和轻DNA进行分析,可以了解活性和非活性微生物群落,从而知道哪些微生物在起作用。SIP技术非常明显的优点是可以明确群落中实际起作用的微生物,但也有一些缺点。如不易检测数量很少但活性很高的微生物的活性;鉴于DNA中要求N的含量相对较低，SIP技术比较适合研究与碳素转化有关的活性微生物群落。4、稳定同位素?方法2023/2/543什么是微生物生态学？微生物生态学的研究方法有哪些？每种方法的优缺点是什么？举例说明上节内容回顾2015.12.12023/2/5442023/2/545基本知识氨氧化NH3+→NO2-→NO3-硝化作用

amoA（功能基因）氨氧化细菌（AOB）,氨氧化古菌（AOA）抑制剂的使用：（1）dicyandiamide(DCD,双氰胺)，allylthiourea（烯丙基硫脲），Nitrapyrin（三氯甲基吡啶）【对AOA和AOB均有抑制性，但对AOB的抑制作用更强】；

（2）karrnamycin；sulfathiazole（磺胺噻唑）抗生素类，AOB；

（3）NO-scavengercarboxy-PTIO【强烈抑制AOA，对AOB影响不大】二者的功能基因的序列不同，可以用不同的引物分别扩增PNR：potentialnitrificationrate大多数AOA属于自养型，少数混养型2023/2/5462023/2/547文章剖析主要观点：强酸性土壤中氨氧化古菌比氨氧化细菌对氨氧化所起的作用更重要涉及到的微生物生态学方法：分子生物学（PCR,DGGE）稳定同位素标记（SIP）生理生化方法2023/2/548主要论据SignificantlypositivecorrelationsbetweennitrateconcentrationandamoAgeneabundanceofAOA,butnotofAOB.13CO2-DNA-stableisotopeprobingresultsshowedsignificantassimilationof13C-labeledcarbonsourceintotheamoAgeneofAOA,butnotofAOB.Additionofthenitrificationinhibitordicyandiamide(DCD,双氰胺)completelyinhibitedthenitrificationactivityandCO2fixationbyAOA,accompaniedbydecreasingthaumarchaealamoAgeneabundance.BacterialamoAgeneabundancedecreasedinallmicrocosmsirrespectiveofDCDaddition,andmostlyshowednocorrelationwithnitrateconcentrations.2023/2/549DCD的加入能强烈抑制土壤中氨氧化作用的进行.无抑制剂添加抑制剂2023/2/550DCD的加入使得AOA

amoA基因丰度减少AOAamoA拷贝数无DCD添加DCD2023/2/5