第十一章荧光分析法

第十一章荧光分析法药物分析教研室2主要内容第一节荧光分析法的基本原理第二节荧光定量分析方法第三节荧光分光光度计和其他荧光分析技术3

某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。光致发光荧光luorescence磷光phosphorescence

荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。

概述荧光紫外可见相同点分子光谱分子光谱不同点本质发射光谱吸收光谱灵敏度10-8~10-10g/ml10-5~10-7g/ml选择性高一般荧光分析法与紫外可见吸收光谱比较5第一节荧光分析法的基本原理（一）分子荧光的产生一、分子荧光molecularfluorescence1、分子的电子能级与被激发过程分子的能级包括：电子能级（10ev）、振动能级(0.1ev)及转动能级(0.001ev)1、分子的电子能级与被激发过程

单重态：singletstate(S)

三重态：tripletstate(T)电子能级的多重性M:M=2S+1；S为总自旋量子数6跃迁类型的比较跃迁类型基态→激发单重态S*基态→激发三重态T*所需能量大小自旋方向不变改变跃迁几率接近于110－6（光学禁阻）82、荧光的产生S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

4

外转换l

3T2内转换振动弛豫910激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；荧光延迟荧光磷光辐射跃迁无辐射跃迁传递途径内转移外转移系间跨越振动弛豫荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态磷光：10-4～10s；

第一激发三重态的最低振动能级→基态（1）振动弛豫（vibrationalrelexation）过程：激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量传递给溶剂分子，其电子由同一电子能级激发态的较高振动能级回到最低振动能级的过程。特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时间约10-12秒。或11S2S1S0吸收发射荧光振动弛豫能量l2l1

振动弛豫12（2）内部能量转换（internalconversion)过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低电子能级，这种过程称为内部能量转换特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有重叠；时间约10-1～10-13秒。或13S2S1S0吸收内转换振动弛豫能量l2l1内转换振动弛豫处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量转换，均回到第一激发态的最低振动能级过程：振动弛豫→内部能量交换→振动弛豫注：15（3）荧光（fluorescence）过程：电子由单重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的任一振动能级而发射的光量子为荧光特点：发生在激发单重态最低振动能级与基态之间。时间约为10-7～10-9s。注：

发射荧光的能量比吸收的能量小1>0

即发射波长>激发波长16S2S1S0T1吸收发射荧光内转换振动弛豫能量l2l1l

3T2内转换振动弛豫（4）外部能量转换（externalconversion)过程：如果分子在溶液中被激发，激发分子之间、分子与溶剂之间会发生碰撞而失去能量，这种非辐射跃迁的过程称为外部能量转换特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所需时间约为10-7～10-9秒。结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭18S2S1S0T1吸收发射荧光内转换振动弛豫能量l2l1

外转换l

3T2内转换振动弛豫（5）体系间跨越（intersystemcrossing)过程：处于激发态的电子自旋方向发生改变，而使电子能级的多重性发生变化的过程特点：激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，产生体系间的跨越（S1*→T1

）。结果：这种跨越会导致荧光强度减弱，甚至熄灭。20S2S1S0T1吸收发射荧光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

4外转换l

3T2内转换振动弛豫影响体系间跨越几率增大的因素：含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体系间跨越的发生几率。原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的发生。22（6）磷光（phosporescence）过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的任一振动能级而发射的光量子为磷光特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。分子在三重态的最低振动能级上可以存活一段时间，发射时间约为10-4～10s。注：

发射磷光的能量比荧光的能量小，2>1>0

即磷光波长>荧光波长>激发波长23S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

4

外转换l

3T2内转换振动弛豫24荧光与磷光的比较荧光磷光跃迁激发单重态最低振动能级→基态激发三重态最低振动能级→基态光电子能量E激发＞

E荧光＞E磷光波长λ激发＜λ荧光＜λ磷光发射时间10-9~10-7秒10-4~10秒25（二）

激发光谱与发射（荧光）光谱激发波长发射波长——荧光物质分子的两个特征光谱激发光谱(excitationspectrum)：F~ex

荧光光谱(fluorescencespectrum)：F~em26（二）激发光谱与荧光光谱激发光谱：（与吸收光谱类似）表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光所得的光谱。方法：固定发射光波长λem，依次改变激发波长λex，测荧光强度F，以F-λex作图得荧光物质的激发光谱。发射光谱：（荧光光谱）固定激发光波长λex，依次改变发射波长λem，测荧光强度F，以F-λem作图得荧光光谱。激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的依据27荧光光谱的特征（重点）（1）斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发波长。原因：无辐射跃迁能量损失，包括振动弛豫和内部能量转换等（2）荧光光谱的形状与激发波长无关原因：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。（3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。28

蒽的激发光谱和荧光光谱S0S1*ν=4ν=3ν=2ν=1ν=0ν=4ν=3ν=2ν=1ν=0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4ΔE4ΔE3ΔE2ΔE1ΔE4ΔE3ΔE2ΔE1蒽的能级跃迁图镜像关系的原因由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。29二、荧光的产生与分子结构的关系

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure荧光寿命(f)和荧光效率(f)

荧光寿命：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需要的时间荧光量子产率（）：物质的荧光量子产率范围一般是多少?如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。二、荧光的产生与分子结构的关系

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure

1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构—有强的紫外可见吸收；（2）具有一定的荧光量子产率（荧光效率）。32（二）分子结构与荧光的关系1）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移

二、荧光的产生与分子结构的关系

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure332）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。343）取代基效应给电子取代基-OH,-CN，-NH2等，可扩大共轭双键体系加强荧光得电子取代基-C=O,-NO2-COOH，-SH等减弱荧光重原子效应：芳环上取代F、Cl、Br、I之后，系间窜跃加强，荧光强度随卤素原子量取代基的位置：邻、对位荧光增强，间位抑制35（三）荧光试剂（了解）1)荧光胺—本身不显荧光，能与脂肪族、芳香伯胺形成荧光衍生物。λex=275、390nm，λem=480nm2)邻苯二甲醛（OPA）—伯胺，α-氨基酸

λex=340nm,λem=455nm3）丹酰氯—含伯、仲胺及酚基的生物碱

丹酰肼—可的松的羰基

λex=365nm,λem=500nm4）无机离子—具有π电子结构的有机化合物1、温度：低温，φf↑。原因：温度T↑，分子运动加快，磁撞几率↑无辐射跃迁↑2、溶剂：①溶剂介电常数↑，极性↑，π→π*ΔE↓,φf↑，λ↑②溶剂粘度σ↑，φf↑三、影响荧光强度的外部因素

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure363、pH影响对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；4、荧光熄灭剂的影响荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物。给电子基团3738熄灭机理：

a碰撞失去能量

b生成不发光的配合物

c溶解氧的存在使荧光物质氧化或氧分子的顺磁性使激发单重态分子转变为三重态d浓度较大，自熄灭现象5、散射光的干扰散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，小部分光线由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。瑞利光:光子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方向改变，这种散射光称为瑞利光。其波长与入射光相同。拉曼光:光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质有能量交换，散射光波长有所改变，增大或减小，这种散射光为拉曼光。波长增大的拉曼光对荧光测定有干扰39硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)荧光光谱散射光谱4041能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好，取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：42第二节荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系当一束强度为I0的紫外/可见光照射一浓度为c、液层厚度为l的液槽时，可在溶液的各个方向观察到荧光，其吸收光强度为Ia透过光强度为It荧光强度为FI0It

IaF垂直方向（=I0-It）荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度IaF=K’(I0–It)K’：取决于荧光效率f根据BeerLaw=10-clItI0F=K’(I0-

I010-cl)=K’I0(1-

10-cl)=K’I0(1-

e–2.303cl)由于ex=1+x+x2/2!+x3/3!+…+xn/n!所以e-2.3cl

=1-2.3cl

+(-2.3cl)2/2!+(-2.3cl)3/3!+…e-2.3cl

=1-2.3cl

43e-2.3cl

=1-2.3cl代入

F=

K’I0(1-

e–2.303cl)F=K’I0(1-

1+2.3cl

)=2.3K’I0

lc

当荧光效率f、入射光强度I0、物质的摩尔吸收系数、液层厚度l均固定不变时，荧光强度正比于该溶液的浓度F=K

c荧光定量分析的依据4445二、定量分析方法1.工作曲线法

配制一系列标准浓度试样，测定荧光强度，绘制F-c的标准校正曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出试样的浓度空白调0，标品调100%或50%462、比例法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度3、多组分样品的荧光分析

a无相互干扰，分别测定

b有干扰，同紫外－可见吸收光谱定量方法