第八章 脂类代谢与控制

第八章脂类代谢与控制

目的掌握脂类代谢途径、脂类代谢的调节方式；掌握多不饱和脂肪酸、谷氨酸发酵的生物合成途径、发酵机制、代谢控制育种内容脂类代谢途径和调节方式；多不饱和脂肪酸、谷氨酸发酵的生物合成途径、发酵机制、代谢控制育种重点多不饱和脂肪酸、谷氨酸发酵的生物合成途径难点谷氨酸发酵的生物合成途径、发酵机制学时

3第一节

脂类代谢与调节一、脂肪酸的氧化分解

脂肪酸在有充足氧供给的情况下，可氧化分解为CO2和H2O，释放大量能量，因此脂肪酸是机体主要能量来源之一。脂肪酸氧化最主要的氧化形式是β-氧化。(一)脂肪酸的β-氧化过程此过程可分为活化，转移，β-氧化共三个阶段。1.脂肪酸的活化

R—COOH+ATP+HS-CoA脂酰CoA合成酶R-CO-SCoA+AMP+PPiMg++2.脂酰CoA进入线粒体：催化脂肪酸β-氧化的酶系在线粒体基质中，但长链脂酰CoA不能自由通过线粒体内膜，要进入线粒体基质就需要载体转运，这一载体就是肉毒碱，即3－羟－4－三甲氨基丁酸。长链脂肪酰CoA和肉毒碱反应，生成辅酶A和脂酰肉毒碱，脂肪酰基与肉毒碱的3-羟基通过酯键相连接。肉毒碱脂酰转移酶脂肪酰CoA-肉毒碱脂肪酰肉毒碱+HSCOA3.β-氧化的反应过程：脂酰CoA在线粒体基质中进入β氧化要经过四步反应，即脱氢、加水、再脱氢和硫解，生成一分子乙酰CoA和一个少两个碳的新的脂酰CoA。

脂肪酸β-氧化反应步骤脂肪酸CoA-SH＋脂酰-CoA反式Δ2烯脂酰-CoAL-3-羟脂酰-CoAβ-酮脂酰-CoA乙酰-CoA脂酰-CoA硫激酶ATPAMPPPi脂肪酸活化脂酰-CoA脱氢酶FADH2烯脂酰-CoA水合酶H2O羟脂酰-CoA脱氢酶NADH硫解酶（脱下了两个碳原子）

(二)脂肪酸β-氧化的生理意义脂肪酸β-氧化是脂肪酸分解的主要途径，脂肪酸氧化可以供应机体所需要的大量能量，以十八个碳原子的饱和脂肪酸硬脂酸为例，其β-氧化的总反应为：

CH3(CH2)15COSCoA+8NAD+CoASH+8H2O→9CH3COSCoA+8ADH2+8NADH+8H+8分子FADH216分子ATP，8分子NADH24分子ATP，9分子乙酰CoA完全氧化提供108个分子ATP，因此一克分子硬脂酸完全氧化共提供148克分子ATP。硬脂酸的活化过程消耗1克分子ATP，所以一克分子硬脂酸完全氧化可净生成147克分子ATP。

二、脂肪酸的合成(一)软脂酸的生成脂肪酸的合成首先由乙酰CoA开始合成，产物是十六碳的饱和脂肪酸即软酯酸。1.乙酰CoA的转移乙酰CoA可由糖氧化分解或由脂肪酸、酮体和蛋白分解生成，生成乙酰CoA的反应均发生在线粒体中。脂肪酸的合成部位是胞浆。乙酰CoA必须由线粒体转运至胞浆。乙酰CoA不能自由通过线粒体膜。乙酰CoA通过线粒体膜，需要通过一个称为柠檬酸-丙酮酸循环来完成乙酰CoA由线粒体到胞浆的转移。首先在线粒体内，乙酰CoA与草酰乙酸经柠檬酸合成酶催化，缩合生成柠檬酸再由线粒体内膜上相应载体协助进入胞液，在胞液内存在的柠檬酸裂解酶可使柠檬酸裂解产生乙酰CoA及草酰乙酸。前者即可用于生成脂肪酸，后者可返回线粒体补充合成柠檬酸时的消耗。草酰乙酸也不能自由通透线粒体内膜，故必须先经苹果酸脱氢酶催化，还原成苹果酸再经线粒体内膜上的载体转运入线粒体，经氧化后补充草酰乙酸。也可在苹果酸酶作用下，氧化脱羧生成丙酮酸，同时伴有NADPH的生成。丙酮酸可经内膜载体被转运入线粒体内，此时丙酮酸可再羧化转变为草酰乙酸。每经柠檬酸丙酮酸循环一次，可使一分子乙酸CoA由线粒体进入胞液，同时消耗两分子ATP。

2.丙二酰CoA的生成

乙酰CoA由乙酰CoA羧化酶催化转变成丙二酰CoA反应如下：

乙酰CoA羧化酶CH3COSCOA+HCO-3+ATP

CH3COSCOA

COOH

乙酰CoA羧化酶存在于胞液中，其辅基为生物素，在反应过程中起到携带和转移羧基的作用。由乙酰CoA羧化酶催化的反应为脂肪酸合成过程中的限速步骤。此酶为一变构酶，柠檬酸与异柠檬酸抑制该酶活性。乙酰CoA羧化酶还可通过依赖于cAMP的磷酸化及去磷酸化修饰来调节酶活性。同时乙酰CoA羧化酶也是诱导酶，长期高糖低脂饮食能诱导此酶生成，促进脂肪酸合成；反之，高脂低糖饮食能抑制此酶合成，降低脂肪酸的生成。

3.软脂酸的生成软脂酸的合成实际上是一个重复循环的过程，由1分子乙酰CoA与7分子丙二酰CoA经转移、缩合、加氢、脱水和再加氢重复过程，每一次使碳链延长两个碳，共7次重复，最终生成含十六碳的软脂酸。在原核生物(如大肠杆菌中)催化此反应的酶是一个由7种不同功能的酶与一种酰基载体蛋白（ACP)聚合成的复合体。在真核生物催化此反应是一种含有双亚基的酶，每个亚基有7个不同催化功能的结构区和一个相当于ACP的结构区，因此这是一种具有多种功能的酶。脂肪酸合成需消耗ATP和NADPH，NADPH主要来源于葡萄糖分解的磷酸戊糖途径。此外，苹果酸氧化脱羧也可产生少量NADPH。脂肪酸合成过程不是β-氧化的逆过程，它们反应的组织，细胞定位，转移载体，酰基载体，限速酶，激活剂，抑制剂，供氢体和受氢体以及反应底物与产物均不相同。

脂肪酸合成的反应步骤乙酰-CoA乙酰-ACP乙酰-合酶启动乙酰-CoA：ACP转酰酶ACP脂肪酸合酶丙二酸单酰-CoA丙二酸单酰-ACP丙二酸单酰CoA:ACP转酰酶装载缩合乙酰乙酰-ACPβ-羟丁酰-ACPβ-烯丁酰-ACP+丁酰-ACPβ-酮酰-ACP合成酶β-酮酰-ACP还原酶β-羟酰-ACP脱水酶烯酰-ACP还原酶NADPHNADPHH2OC2O还原还原脱水软脂酸软脂酰-ACP硫脂酶释放三、脂类代谢的调节以及与糖代谢的相互关系（一）运送乙酰基乙酰CoA在脂肪酸台成中起着重要的作用。在线粒体内，由糖酵解产生的丙酮酸被氧化生成乙酰CoA。脂肪酸的β—氧化作用在线粒体中进行，而脂肪酸的合成却在细胞质中进行。因为脂肪酸合成所需要的碳源来自乙CoA，而乙酰CoA不能透过线粒体膜进入到细胞质中．所以从线粒体向细胞质供给乙酰CoA的反应成为肪脂酸合成的前提条件。（二）限速反应脂肪酸合成是以乙酰CoA为引物、通过对脂肪酸合成起限速作用的反应进行的。此反应需要生物素作辅酶，乙酰coA羧化酶为关键酶．乙酰coA羧化酶受长链脂CoA的反馈抑制，为柠檬酸所激活。为了增加微生物的脂肪酸生物合成，可以从以下几方面考虑。(1)选育乙酰CoA羧化酶活力强的菌株，设法解除终产物(脂酰COA及脂肪酸)的反馈抑制。例如：①选育抗代谢产物结构类似物突变株(抗脂肪酸结构类似物)。②选育营养缺陷型的回复突变株或选育条件突变株，解除生物细胞正常的自我调节，使脂肪酸得以积累。(2)选育易生成并大量积累柠檬酸的菌株。(3)以石油为碳源发醇脂肪酸时，应强化烃氧化酶氧化酶系。（三）能荷调节脂肪酸分解与合成的速度受TCA循环中异柠檬酸脱氢酶的调节。细胞内ATP水平高，异柠檬酸脱氢酶活性受抑制，柠檬酸得以积累。柠檬酸透过线粗体膜，进入细胞质中，在细胞质中合成乙酰CoA，被利用于脂肪酸的生物合成当ATP水平低时，在线粒体内积累AMP，异柠檬酸脱氢酶活性明显增加，结果导致丁C入循环整体活性升高，柠檬酸被氧化，几乎看不到柠檬酸从线粒体向细胞质游离，脂肪酸不再合成。

从能荷调节的角度出发，增加脂肪酸的合成可从以下几方面考虑(1)

提高能荷，即提高微生物细胞内ATP的水平，将有利于脂肪酸的合成。(2)

选育丧失或只具有微弱柠檬酸脱氢酶活力的突变抹，如异柠檬酸脱氢酶的渗漏突变抹等。(3)考虑有利于柠檬酸合成而不利于柠檬酸降解的突变株或条件，如添加异柠檬酸脱氢酶抑制剂或选育对抑制剂敏感的突变株，均有利于脂肪酸的大量积累。

第二节多不饱和脂肪酸发酵的代谢育种控制

一、概述多不饱和脂肪酸的概念：多不饱和脂肪酸指含有两个或两个以上双键且C原子数在16—22的直链脂肪酸。多不饱和脂肪酸主要有：γ—亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸EPA

、二十二碳六烯酸（DHA）亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、多存在于植物油中，如红花、月见草、大豆、玉米、棉籽、亚麻、葵花籽菜籽等油脂中。多不饱和脂肪酸在人体内易于乳化、输送和代谢，不易在动脉壁上沉淀，有着良好的降血脂作用。近来有报道谈到过高的摄入多不饱和脂肪酸会在降低胆固醇的同时，将对人体有益的高密度脂蛋白胆固醇也给降低了。所以不提倡过多地食入，但不可缺少。尤其对高血脂人群来讲，适量食用是有益的。DHA和EPA主要存在于鱼油中，尤其是深海冷水鱼油中含量较高。DHA很容易通过大脑屏障进入脑细胞，存在于脑细胞及脑细胞突起中。人脑细胞脂质中有10％是DHA，因此DHA对脑细胞的形成和生长起着重要的作用，对提高记忆力、延缓大脑衰老有着积极的意义。二、γ—亚麻酸发酵的代谢育种控制（一）γ—亚麻酸的生物合成途径见下图

葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸乙酰COA丙二酸单酰ACP硬脂酸

油酸亚油酸ά-亚麻酸γ—亚麻酸花生四烯酸二十碳五烯酸二高γ—亚麻酸前列腺素(二)γ—亚麻酸发酵的代谢育种1.育种思路2.出发菌株选择一般采用孢霉、毛霉、红酵母、小克银汉霉等3.切断或减弱支路代谢采用α—亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸缺陷突变株4．解除反馈调节选育抗性突变株、耐高浓度γ—亚麻酸突变株可解除反馈调5．强化能量代谢提高细胞内ATP水平6.增加前体物的合成增高HMP途径7．选育△6-脱氢酶活力强的突变株8．选育低温生长突变株9．选育耐高糖的突变株三、花生四烯酸发酵的代谢育种(一)花生四烯酸的生物合成途径葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸乙酰COA丙二酸单酰ACP硬脂酸

油酸亚油酸ά-亚麻酸γ—亚麻酸花生四烯酸二十碳五烯酸二高γ—亚麻酸前列腺素(二)花生四烯酸发酵的育种思路1．出发菌株的选择多采用耳霉属、被孢霉属、毛霉属和根霉属等产油脂较多的真菌作为出发菌株。2．切断或减弱支路代谢选育α—亚麻酸缺陷、二十碳五烯酸缺陷、DHA缺陷、前列腺素缺陷突变株，或者选育DHA渗漏、α—亚麻酸渗漏及前列腺素渗漏突变株。3．解除自身的反馈调节通过选育脂肪酸结构类似物抗性突变株的方法来达到目的。另外，选育耐高浓度花生四烯酸的突变株，也有助于提高花生四烯酸的产量。4．增加前体物的合成选育脱氢赖氨酸敏感、萘啶酮酸敏感、氟乙酸敏感、狭霉素C敏感、德夸菌素敏感突变株，均有利于加强HMP途径，从而增加花生四烯酸生物台成的前体物。由于花生四烯酸的前体物是γ—亚麻酸．因此，凡能提高γ—亚麻酸产量的遗传标记，也有利于花生四烯酸的大量积累。5．选育△5—脱饱和酶活性强的突变株△5—脱饱和酶是花生四烯酸生物合成中的关键酶之一，其活性的高低直接影响了花生四烯酸的产量。代谢控制育种中也可用TTC酶活测定法来反映A5—脱饱和酶的活性。TTC酶促反应的颜色(红色)越深，表明体内△5—脱饱和酶的活性越强，花生四烯酸的产量越高。6．选育低温生长突变株在相对低温条件下生长良好的突变株，有助于花生四烯酸产量的提高。7．挑选脂肪粒大、密度高的突变株对菌株镜检，可观察到菌丝体内存在折光性很强的液滴——脂肪粒。用苏丹l对菌丝体染色，液滴呈红色；用苏丹黑对菌丝体染色，液洒呈深蓝色。挑选脂肪粗大、密度高的突变株，有助于花生四烯酸产量的提高。8．提高细胞内的能荷水平细胞内ATP水平高时，在细胞质中合成的乙酰CoA被用于脂肪酸的生物合成。若细胞内ATP水平降低，则脂肪酸的生物合成终止，也就不可能合成花生四烯酸。要提高花生四烯酸的积累量，可采用寡霉素抗性、羟胺抗性、氧化丙二酸抗性、亚砷酸抗性等遗传标记。第三节谷氨酸发酵谷氨酸发酵是控制磷脂合成代谢的典型例子。在正常情况下，谷氨酸产生菌的细胞膜不允许谷氨酸从细胞内渗透到细胞外。在谷氨酸发酵过程中，一般是通过控制生物素亚适量、添加吐温60或青霉素等手段来调节细胞膜的渗透性，使细胞允许谷氨酸从细胞内渗透到细胞外。一谷氨酸生物合成途径葡萄糖6-磷酸葡萄糖3-磷酸甘油醛磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸a-酮戊二酸琥珀酸延胡索酸苹果酸草酰乙酸乙醛酸乙酰CoA6-磷酸葡萄糖酸5-磷酸核糖CO2CO2EMPHMPTCADCA谷氨酸CO2CO2谷氨酸的生物合成由糖经过酵解途径（EMP）和单磷酸已糖途径（HMP）生成丙酮酸。一方面，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA；另一方面，经CO2固定作用生成草酰乙酸；两者合成柠檬酸进入三羧酸循环TCA），由三羧酸循环的中间产物a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基合成谷氨酸二、谷氨酸发酵的代谢调节机制2.1优先合成谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢流转向合成天冬氨酸。

2.2谷氨酸脱氢酶(GDH)的调节谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏。

2.3柠檬酸合成酶的调节柠檬酸合成酶受能荷调节、谷氨酸的反馈阻遏和顺乌头酸的反馈抑制。2.4．异柠檬酸脱氢酶的调节细胞内α—酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡。当。α—戊二酸过量时，对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成α—酮戊二酸。2.5α—酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸产生菌中先天性地丧失或微弱。2.6磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。2.7谷氨酸的合成与糖代谢、氮代谢的调节有关。关于糖代谢的调节、主要有：

①能荷控制：糖代谢的调节主要受能荷的控制，糖代谢最主要的生理功能是以ATP的形式提供能量。②生物素的影响：生物素对糖代谢的影响，主要是影响糖降解速度。在生物素充足的条件下，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出。关于氮代谢的调节，控制谷氨酸发酵的关键之—就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸和参与蛋白质合成。在生物素亚适量的情况下，异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞。导致蛋白质合成活动停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨酸，生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白质。在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强．谷氨酸减少，生成的谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。三、谷氨酸生产菌的育种思路3.1切断或减弱支路代谢1．减弱α—酮戊二酸进一步氧化

2．选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株

在谷氨酸生物合成途径中，从葡萄搪到丙酮酸的反应是由EMP途径和HMP途径组成的。但是，通过HMP途径也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基酸、辅酶Q、维生素K、叶酸等物质。这些物质的生成消耗了葡萄糖，使谷氨酸的产率降低，如果削弱或切断这些物质的合成，就会使谷氨酸的产率增加。①选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长的突变株。②选育抗嘌吟、嘧啶类似物的突变株。③选育抗核苷酸类抗生素突变株，如德夸菌素性突变株。

3．选育不分解利用谷氨酸的突变株

为了积累谷氨酸，就必须使菌种不能分解谷氨酸，切断α—酮戊二酸继续向下氧化的反应，即选育以谷氨酸为唯一碳源，菌体不长或生长微弱的突变样。４．选育减弱乙醛酸循环的突变株四碳二羧酶是由CO2固定反应和乙醛酸循环所提供的，减弱乙醛酸循环，固定反应所CO2占的比例就会增大，谷氨酸的产量就高。

①选育琥珀酸敏感型突变株。

②选育不分解利用乙酸的突变株。

③利用基因工程技术，使异柠檬酸裂解酶活力降低。5．阻止谷氨酸进一步代谢

3.2解除自身的反馈调节1．选育耐高渗透压的菌株

①耐高糖突变株，选育在含20％一30％葡萄糖的平板上生长好的突变株。

②耐高谷氨酸突变抹：选育在含15％一20％味精的平板上生长好的突变抹。③耐高糖、高谷氨酸突变株：选育在