b第二章微生物发酵产酶

Chapter2

TheproductionofEnzymebyFermentationofMicroorganism微生物发酵产酶1酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillusPlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample微生物发酵产酶植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶2Contentsofchapter21、酶生物合成过程2、常见产酶微生物4、酶的发酵工艺条件及控制5、酶生产过程的动力学6、动植物细胞培养产酶3、微生物发酵法生产酶的方式32.1酶生物合成过程ThebiosynthesisprocessofEnzyme1、中心法则-CentralDogma2、RNA的生物合成-Transcription3、蛋白质的生物合成-Translation4、酶生物合成的调节-RegulationGoGoGoGo下一节本章目录4Reversetranscription1、中心法则-CentralDogma5Replication复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。Transcription转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。Translation翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。Reversetranslation逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。本节目录62、RNA的生物合成(转录)-Transcription细胞内RNA的生物功能(1)在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。(2)在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。(3)某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。(4)各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。7转录过程的特点1、转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。反义链antisensestrand（无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。有义链codingstrand（编码链，正链）：在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。2、转录所需酶：依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是以DNA为模板的一类RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由1种RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3种，分别为RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为4～10个，亚基种类有4～6种。8转录过程起始位点的识别recognition转录起始initiation链的延伸elongation转录终止termination转录后加工modification9TheE.coliRNApolymeraseholoenzymeconsistsofsixsubunits:a2bb’s.PossiblecatalyticsubunitsPromoterspecificityEnzymeassembly,promoterrecognition,activatorbindingRoleunknown(notneededinvitro)36.5kDa15115511kDa(32-90kDa)10本节目录113、蛋白质的合成(翻译)-Translation翻译:以RNA中mRNA为模板,按照其核苷酸顺序所组成的密码指导蛋白质的合成的过程.mRNA蛋白质翻译

各种信息各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）12蛋白质合成的几个要素-mRNA(模板，template)mRNA是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。以mRNA为模板,合成一定结构的多肽链的过程(翻译)，就是将mRNA分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。13蛋白质合成的几个要素-遗传密码，nucleotidetripletcodonmRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联密码。四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子。其中：一个起始密码:AUG三个终止密码:UAAUGAUAG多数氨基酸拥有2-4个密码141516蛋白质合成的几个要素-转运RNA(transporter)tRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。tRNA有特异性，至少有20种以上。每种tRNA的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的反密码，能与mRNA上相应的密码互补结合。17酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密码mRNA密码(codon)与反密码(anticodon)的碱基配对18蛋白质合成的几个要素-核糖体，ribosome核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。19Theribosomecompositionofprokaryoticandeukaryoticcell沉降系数就是用来表示生物组织成分在离心力场下沉淀下来的速度大小，沉降系数越大，越先沉降20蛋白质合成的几个要素-其他因子和酶其他辅助因子工具酶21蛋白质的合成过程肽链合成的起始initiation肽链合成的延伸elongation肽链合成的终止与释放terminationandrelease合成多肽的输送和加工transportandmodification蛋白质分子的折叠folding22氨基酸活化生成氨酰-tRNA23原核生物肽链合成的起始阶段是在GTP和起始因子（InitiationFactor）的参与下，核糖体30S亚基，fMet-tRNAF，mRNA和50S亚基结合，组成起始复合物的过程。主要包括5个步骤：（1）30S亚基与起始因子IF3结合；（2）30S亚基与mRNA结合，形成30S-IF3-mRNA复合物；（3）fMet-tRNAF与起始因子IF2以及GTP结合，生成fMet-tRNAF-IF2-GTP；（4）在起始因子IF1的参与下，fMet-tRNAF-IF2-GTP与30S-IF3-mRNA结合生成30S起始复合物。在此30S起始复合物中，fMet-tRNAF上的反密码子正好与mRNA上的起始密码子AUG结合；（5）50S亚基与上述30S起始复合物结合，形成完整的70S核糖体。同时放出IF1，IF2，IF3，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70S核糖体形成时，fMet-tRNAF位于70S核糖体的“P”位（肽酰基位），而它的“A”位（氨酰基位）是空位。蛋白质合成起始24进位转位成肽25合成终止26高效率的蛋白质合成体系27蛋白质的空间结构如何形成？功能与结构如何统一？体外、体内的结构如何变化？蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要越来越多的基因工程产物需要复性复活,要求蛋白质折叠的理论及技术的指导。基因工程重组蛋白类产物必须要形成正确的折叠才能表现出功能和活性。蛋白质的折叠本节目录28ABEX底物水平的调节酶水平的调节

酶活性的调节酶含量的调节酶的定位调节辅助因子调节生长发育的不同时期外界环境变化酶合成与分解速度的变化（基因表达调控）产物调节细胞内酶的调控模式4、酶生物合成的调节(regulation)29组成型酶在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大。

如DNA聚合酶，RNA聚合酶，糖酵解途径中的各种酶。适应型酶在细胞中的含量变化较大，其合成速率明显受到环境因素的影响。适应型的酶的生物合成受到的调节控制：转录水平的调节、转录产物的加工调节、翻译水平的调节、翻译产物的加工调节和酶降解的调节。4、酶生物合成的调节(regulation)30酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控。酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。31转录水平的调节又称基因调节理论与酶的生物合成关系密切的基因：调节基因、启动基因、操纵基因、结构基因。启动基因决定酶的合成能否开始，由两个位点组成，一个是RNA聚合酶的结合位点，另一个是cAMP与CAP组成的复合物（cAMP-CAP）的结合位点。CAP是cAMP受体蛋白或分解代谢物活化剂蛋白。只有cAMP-CAP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA聚合酶才能结合到其在启动基因上的相应位点上，转录才有可能开始，否则酶就无法开始合成。调节基因可以产生一种阻遏蛋白，当阻遏蛋白与操纵基因结合时，由于空间排挤作用，RNA聚合酶就无法结合到启动基因的位点上，也无法进入到结构基因的位置进行转录，因而无法将DNA上的遗传信息转录到mRNA分子上，酶的生物合成无法进行。只有当阻遏蛋白与效应物结合，改变结构而不与操纵基因结合时，RNA聚合酶才能结合到启动基因的位点上，才能开始酶的生物合成。32启动基因、操纵基因、结构基因一起组成操纵子。在原核生物中，操纵子有两种类型，即诱导型和阻遏型。诱导型操纵子在无诱导物的情况下，其基因的表达水平很低或不表达，只有在有诱导物的情况下，才能转录生成mRNA，进而合成酶阻遏型操纵子在无阻遏物的情况下，基因正常表达，当有阻遏物存在时，转录受到阻遏。转录水平的调节主要有3种模式，分解代谢物阻遏作用、酶合成的诱导作用和酶合成的反馈阻遏作用33分解代谢物阻遏作用某些物质（主要指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象如葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生物合成，果糖阻遏α-淀粉酶的生物合成。添加一定量的cAMP可以减少或解除分解代谢物阻遏作用。34细菌乳糖操纵子的作用机制(分解代谢物阻遏)调节基因启动子操纵基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP复合物mRNA当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶（将ATP转变成cAMP）有抑制作用，则cAMP的浓度降低，CAP-cAMP复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶过去称葡萄糖效应35酶生物合成的诱导作用酶合成诱导的现象—JacobandMonod的工作：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：

1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；

2.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失；

3.表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。

本世纪三十年代，H.Karstrom在对糖代谢过程中的某些酶的合成进行研究时提出：诱导酶与组成酶加入某种物质使酶的生物合成开始或加速进行的过程，叫做酶合成的诱导。能诱导酶合成的物质叫诱导物。被诱导合成的酶叫诱导酶。36乳糖操纵子的结构无诱导物存在时，调节基因产生的阻遏蛋白（lacrepressor）与操纵基因（Olac）的结合力强，结构基因无法进行转录，酶的生物合成受阻。37诱导机制当培养基中以乳糖为唯一碳源时，细胞吸收乳糖变为别乳糖，别乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白结构改变，与操纵基因结合力变弱，不再与操纵基因结合，酶的生物合成可以进行。38酶生物合成的阻遏作用酶合成阻遏的现象—JacobandMonod的工作：实验：

1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；

2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。酶生物合成的阻遏作用又称为产物阻遏作用，是指酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到足额的现象。能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物。被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。39调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白在没有阻遏物存在时，调节基因产生的阻遏蛋白与操纵基因的亲和力弱，不能与操纵基因结合，结构基因能够表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物trp当环境中色氨酸浓度增加，阻遏物到达一定浓度时，阻遏蛋白与阻遏物结合，使其结构发生改变，与操纵基因结合，结构基因不能表达色氨酸操纵子（酶的阻遏）

----------阻遏物和操纵基因的调节402.2常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction基本要求：发酵周期短，产量高；容易培养和管理；产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染；利于酶的分离纯化；安全可靠，无毒性。（非致病菌）：凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。41(1)大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。形态：短杆或长杆状，0.5～1.0×1.0～3.0um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。应用： 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖 大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等42(2)醋酸杆菌（Acetobacter）

菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆)山梨糖(维C中间体）43(3)枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）

直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。44(4)根霉(Rhizopus)分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。代表种：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。45(5)曲霉(Aspergillus)分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。代表种：黑曲霉Asp.Niger、黄曲霉Asp.flavus应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。回本节46酶的发酵生产方式固体发酵液体发酵2.3微生物发酵法生产酶的方式47固体发酵表面培养或曲式培养以麸皮、米糠等为基本原料，加入适量的无机盐和水作为培养基进行产酶微生物菌种培养的一种培养技术浅盘培养转桶培养多用通风式厚层培养固体发酵技术原理48固体发酵法设备简单，便于推广，特别适合于霉菌的培养和产酶发酵条件不易控制、物料利用不完全、劳动强度大、容易染菌等优点缺点不适于胞内酶的生产49液体深层发酵浸没式发酵利用液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌通气培养方式酶制剂生产的主要培养方式原料的利用率和酶的产量都较高，培养条件容易控制液体发酵法50工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源酶产酶微生物用途α-淀粉酶枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌，米曲霉淀粉液化，织物退浆，消化助剂，加酶洗涤剂葡萄糖淀粉酶米曲霉，黑曲霉，米根霉制造葡萄糖，发酵、酿酒等工业的淀粉水解糖中性蛋白酶枯草芽胞杆菌，米曲霉皮革、毛皮加工，食品加工，调味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清碱性蛋白酶地衣芽胞杆菌加酶洗涤剂植酸酶黑曲霉，毕赤酵母工程菌株饲料添加剂转化酶啤酒酵母、假丝酵母制造转化糖凝乳酶米赫毛霉、大肠杆菌和真菌生产的重组酶制造乳酪脂肪酶曲霉、根霉、酵母等加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工葡萄糖氧化酶青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖葡萄糖异构酶凝结芽胞杆菌，白色链霉菌生产果葡糖浆青霉素酰化酶细菌、霉菌、放线菌制造6-氨基青霉烷酸纤维素酶里氏木霉、黑曲霉水洗布生产，饲料添加剂，消化植物细胞壁半纤维素酶木霉、曲霉、根霉饲料添加剂，消化植物细胞壁，低聚木糖生产β-葡聚糖酶枯草芽胞杆菌，黑曲霉啤酒酿造，饲料添加剂异淀粉酶产气克雷伯氏菌，芽孢杆菌淀粉加工乳糖酶乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉乳品工业（处理牛乳和乳清）果胶酶曲霉、欧文氏菌水果加工，果汁、果酒澄清，麻类纤维脱胶52酶无菌空气预培养固定化细胞保藏细胞细胞活化培养基固定化原生质体原生质体发酵扩大培养分离纯化工艺流程

2.4酶的发酵工艺条件与控制53一、细胞活化与扩大培养1、生产菌种的来源（1）购买或筛选向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）；中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）。中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）；中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）英国国家典型菌种保藏所（NCTC）54（2）筛选由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。筛选步骤：①样品的采集：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、气、枯枝烂叶、烂水果等。②初筛：分离产目的酶的菌株给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株分离出来。55-淀粉酶的筛选蛋白酶的筛选56③复筛：从所得菌株中筛选优良株在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。④高产菌株的选育诱变育种、细胞杂交、原生质体融合育种、基因工程育种（3）保藏常用的保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法、低温保藏法、石蜡油保藏法。572、生产种子的制备

生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用于发酵罐接种的大量菌体。（1）菌种活化

目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以恢复细胞的生命活动能力。方法：在试管斜面上培养1～3代。58（2）扩大培养

目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获得足够数量的优质细胞。培养基称为种子培养基。59

方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段。扩大培养应注意的事项：（1）尽量减少传代次数，以降低菌种衰退和污染的可能性；（2）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源丰富；（3）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期，及时接入下一级培养或发酵罐；（4）严格控制培养条件（pH、温度、通气量等），加强培养过程的实时监测。60二、培养基的配制培养基的营养成分一般包括碳源、氮源，无机盐、生长因子等。培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。611、碳源在酶的生物合成法生产过程中，首先要从细胞的营养要求和代谢调节方面考虑碳源的选择；此外还要考虑到原料的来源是否充裕、价格是否低廉、对发酵工艺条件和酶的分离纯化是否影响等因素。不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。如黑曲霉具有淀粉酶系，可以采用淀粉为碳源，而酵母不能利用淀粉，只能采用蔗糖和葡萄糖等为碳源。62

当前酶制剂生产使用的菌种大都是只能利用有机碳的异养型微生物。

有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。

此外，以石油产品中12～16碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。632、氮源酶制剂生产中的氮源主要有有机氮源和无机氮源两种。

常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；

无机氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3PO4、尿素等。643、碳氮比碳氮比(C/N)指培养基中碳元素的总量与氮元素总量之比。有的采用碳源总量和氮源总量之比。

一般蛋白酶(包括酸性、中性和碱性蛋白酶)生产采用碳氮比低的培养基比较有利。

淀粉酶(包括α-淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶等)生产的碳氮比一般比蛋白酶生产略高。65在微生物酶生产过程中，培养基的碳氮比也因培养过程不同而异。例如种子培养时，为了适应菌体生长繁殖的需要，种子培养基的碳氮比一般要比发酵培养基低些。

发酵时，不同发酵阶段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草杆菌BF-7658生产α-淀粉酶的发酵过程中，发酵前期要求培养基的碳氮比适当降低，以利菌体生长繁殖，发酵中后期要求培养基的碳氮比适当提高，以促进淀粉酶的生成。664、无机盐不同无机盐在细胞的生命活动中作用不同，如主要组成元素（磷和硫），酶分子的组成元素（磷、硫、锌、钙），酶的激活剂（钾、镁、锌、铜、铁、锰、钙、钼、钴、碘等），调节pH、氧化还原电位和渗透压（钠、钾、钙、磷、氯等）

根据细胞对无机元素需要量的不同，无机元素分为大量元素和微量元素两大类。大量元素：磷、硫、钾、钙、镁、氯等；微量元素：铜、锰、锌、钼、钴、溴、碘等675、生长因子微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才能正常生长发育，这类物质统称生长因子(或生长素)。其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等。酶制剂生产中所需的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。玉米浆中一般含有生长素32~128mg/mL。68三、液体深层发酵的工艺控制酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶性能的影响外，还受到发酵温度、pH、溶氧量等条件的影响。691、温度对产酶的影响微生物生长繁殖和产酶的最适温度随着菌种和酶的性质不同而异，生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。一般细菌为37℃，霉菌和放线菌为28～30℃，一些嗜热微生物需在40～50℃下生长繁殖，如红曲霉生长温度35～37℃，而生产糖化酶的最适温度为37～40℃。70在酶生产中，为了有利于菌体生长和酶的合成，也有进行变温生产的。例如以枯草杆菌ASl.398进行中性蛋白酶生产时，培养温度必须从31℃逐渐升温至40℃，然后再降温到31℃进行培养，蛋白酶产量比不升温者高66%。71

发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅拌速度的变化而变化的。细胞的新陈代谢释放能量,通风搅拌导致发酵液升温。同时由于热量的不断扩散，会导致培养基的温度不断降低。两者决定培养基的温度。

温度调控一般采用热水升温、冷水降温的方法。发酵罐或其他生物反应器均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。722、pH对产酶的影响不同的细胞生长繁殖的最适pH有所不同。细胞发酵产酶的最适pH与生长最适pH往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH通常接近于该酶催化反应的最适pH。73

培养基的pH随着细胞的生长、繁殖和新陈代谢产物的积累，往往会发生变化。一般来说，培养基成分中碳/氮(C/N)比高，由于糖代谢产生有机酸，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N低，发酵液倾向于碱性，pH高。

控制pH的方法：改变培养基的组分和比列；使用缓冲液维持一定的pH；使用酸碱调节pH等。743、溶解氧对产酶的影响细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质（一般是指各种碳源）经过有氧降解而生成大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量ATP。75◆在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。在发酵过程中必须不断供给氧（一般通过供给无菌空气来实现），使培养基中的溶解氧保持在一定的水平。◆细胞对溶解氧的需要量与细胞的呼吸强度及培养基中的细胞浓度密切相关。可以用耗氧速率KO2表示：

KO2=QO2·Cc76◆氧的溶解速度又称为溶氧速率或溶氧系数，以Kd表示。◆溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。◆当溶氧速率和耗氧速率相等时，即：K02=Kd

的条件下，培养液中的溶解氧的量保持恒定，可以满足细胞生长和发酵产酶的需要。77◆调节溶解氧的方法主要有：①调节通气量②调节氧的分压

③调节气液接触时间④调节气液接触面积⑤改变培养液的性质78对于好气性微生物的深层发酵，除了需要通气外，还需要搅拌。搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢。同时可打破空气气泡，从而提高溶氧量，增加空气利用。但搅拌速度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生剪切力，易使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，易使发酵液温度发生变化。搅拌速度还与发酵液黏度有关。4、搅拌的影响795、泡沫的影响消泡措施：一般除了机械消泡外，还可利用消泡剂。理想的消泡剂，其表面相互作用力应低，而且应难溶于水，还不能影响氧的传递速率和微生物的正常代谢。消泡剂主要是一些天然的矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我国常用聚氧丙烯甘油醚或泡敌（聚环氧丙环氧乙烷甘油醚）。80四、提高酶产量的措施1、添加诱导物诱导物一般可以分为3类:酶的作用底物，酶的催化反应产物和作用底物的类似物。2、控制阻遏物的浓度阻遏作用根据其作用机理的不同，可以分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。81控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。◆分解代谢物阻遏作用：控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度，或采用其他较难利用的碳源，如淀粉等，或者采用补料、分次流加碳源等方法，控制碳源的浓度在较低的水平。此外，在分解代谢物阻遏存在的情况下，添加一定量的环腺苷酸（cAMP），可以解除或减少分解代谢物阻遏作用。◆末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。823、添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。表面活性剂离子型和非离子型两大类。其中，离子型表面活性剂又可以分为阳离子型、阴离子型和两性离子型3种。◆将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿（Triton）等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。◆由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如‘新洁而灭’等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。834、添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中，添加适宜的产酶促进剂，往往可以显著提高酶的产量。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1～20倍；842.4酶生产过程的动力学1、酶生产过程中细胞生长动力学2、酶生产过程中产酶动力学3、酶生产过程中基质消耗动力学85酶发酵动力学发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速率、产物生成速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的学科。包括细胞生长动力学、产物生成动力学和基质消耗动力学861、酶生产过程中细胞生长动力学细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。KS

为莫诺德常数，是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。1950年，法国的莫诺德（Monod）首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程。他认为，在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比：假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，μ为这种限制性基质浓度的函数。87莫诺德方程是基本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的各种动力学模型。连续培养时的方程变化形式连续全混流生物反应器进行连续发酵的过程中，连续不断流加培养液并连续排出相同体积的发酵液。在稳态时，游离细胞连续发酵的生长动力学可以表达为：D为稀释率，指单位时间内，流加的培养液的与发酵容器中发酵液体积之比，一般以/h为单位。882、产酶动力学产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或这称为非结构动力学。也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观产酶动力学或称为结构动力学。89（1）酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段90

根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即：

生长偶联型

：同步合成型和中期合成型

部分生长偶联型：延续合成型

非生长偶联型：滞后合成型91同步合成型

酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanaseEC3.1.1.20）。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml总细胞浓度活细胞浓度胞外酶浓度胞内酶浓度92延续合成型

酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml以半乳