研究生转染二

真核细胞转染实验二一、荧光显微镜的工作原理二、荧光蛋白的应用2.1荧光显微镜荧光显微镜（fluorescencemicroscope）

用一定波长（短波长）的光作激发光源照射被检标本，使标本的荧光物质受激发后产生人眼可见的荧光（长波长），再经显微镜成像系统放大后用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

荧光（fluorescence）物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态（激发态），再回到低能状态时释放出的光。短波光物质emission长波光excitation2.11荧光的种类自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光。二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光。自发荧光二次荧光激发光发射光2.12荧光的性质保持固有的荧光特性。荧光波长＞激发波长（STOKES法则）。荧光强度极小于激发光的强度。有不同程度的衰减。荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、pH值、荧光效率。2.13荧光显微镜的种类透射式落射式2.14荧光显微镜的主要部件

透射式汞灯光源激发滤色镜暗场聚光镜吸收滤色镜

落射式汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜滤光器3.141透射荧光显微镜的构造吸收滤色镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯箱透射荧光显微镜原理

目镜吸收滤色镜物镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯吸收滤色镜激发滤色镜分色镜汞灯2.142落射荧光显微镜的构造落射荧光显微镜原理汞灯激发滤色镜分色镜吸收滤色镜物镜标本2.15落射荧光显微镜各部件特性和作用

汞灯光源:

提供激发光(U、V、B、G)

激发滤色镜:

或称初级滤片，置于光源与标本之间，只让规定波长的激发光通过。nmT%BANDPASS

吸收滤色镜:

或称次级滤片，置于物镜与目镜之间,其作用是透射样本发射的荧光，吸收未被标本吸收转变的剩余紫外线等杂光，以排除其对荧光的干扰，并保护眼睛。

分色镜:

在显微镜光路中呈45℃角的位置，反射短波长的激发光，同时透射长波长的荧光。＞A透过A＜A反射B＞B透过＜B阻挡nmnmT%T%2.15落射荧光显微镜各部件特性和作用2.16滤色镜的选择荧光素的特性滤色镜的特性激发分色吸收—根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜激发滤色镜带宽对图象的影响SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:BP470-490FITC+PI2.17荧光色素的选择1.荧光染料：操作快，荧光强。2.荧光蛋白：特异性强，无毒害，可持续表达。2.18注意事项1.接通电源，使高压汞灯进入预热状态,几分钟后该灯便可达到稳定工作状态。2.开启荧光显微镜后10min达到最大的效率，汞灯点亮15min内不要关灯，有助于保持灯的使用寿命，一旦关灯，须等3min后才能重新开启。2.任何时候都不能让细胞处于干燥状态，封片前应将标本玻片浸在PBS中。3.每种荧光染料，均有自己的最适、PH值，此时荧光最强。荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。5.油镜观察时应使用专门的无荧光镜油。CCDcameraConfocal

ConfocalvsCCD细胞标本2.19ConfocalvsCCD激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)1）激光（Laser）单色，高强，方向性，偏振光；2）扫描成像（Scanning）；3）共聚焦（Confocal）；4）显微镜（Microscope）2.191共聚焦（Confocal）1）焦平面上的点和针孔位置呈物像关系（共轭）；2）非焦平面上的点所成的像被针孔屏蔽掉；3）最大限度减少了背景模糊像的干扰PMTxy焦平面上的点成像光路

PMTxy焦平面以下的点的成像光路PMTxy焦平面以上的点的成像光路（植物切片，60um）2.192扫描成像扫描成像两层含义1）单个平面由点扫描生成；2）Z轴扫描（光学切片，细胞CT）(0.1um)三维各层面图像三维影像重组Confocal最佳的图像质量极高的灵敏度多种应用平台扫描时间很长昂贵的成本CCD快速成像相对便宜的价格图像质量不佳对快速成像是最佳选择一、荧光蛋白（fluorescentprotein,FP）二、FP与靶序列（targetingsequence）的融合三、FP与完整目的基因的融合四、转染后筛选2.2融合荧光蛋白在真核细胞中的荧光定位荧光蛋白1992年Prasher等成功维多利亚水母（Aequoreavictoria）克隆到绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）基因的cDNA。1994年Chalfie等首次实现在原核细胞中表达了GFP。分子量小，对转染细胞毒性小，能在多种异源真核细胞中表达。多色突变体或新物种FP的诞生。GFP,RFP转染CHO细胞荧光蛋白基因＋特异性靶序列Fluorescentprotein+KDELERFluorescentprotein+PTS1peroxisomeFluorescentprotein+NLSnucleusFP＋靶序列pEYFP-ERYFPN段融合calrecticulintargetingsequence。C端融合KDELERretentionsequence(Lys-Asp-Glu-Leu)

。pDsRed2-peoxiRFPC末端融合Peroxisomaltargetingsignal（PTS1）(Ser-Lys-Leu)

。pEYFP-ERpDsRed2-peoxiEndoplasmicreticulumoflivingCHOcellsdisplayedbyyellowfluorescentprotein(YFP)YFPlabelER,RFPlabelperoxisomesFP＋完整蛋