现代光分析-6 标记方法

第四章

荧光法在生物分析中的应用FluorescenceProbesinBioanalysis书

名

分子探针与检测试剂作

者

张华山王红赵媛媛出版社

科学出版社书

号

03-009763-7丛

书

分析化学新方法新技术丛书责任编辑操时杰开本A5出版时间2002年8月字数475千字装

帧平装印张0带

盘否页数479蛋白质、核酸、多糖的荧光标记荧光标记物和荧光探针有机荧光染料荧光纳米粒子绿色荧光蛋白为什么要标记？Fluorescein丹磺酰氯例一FITC荧光素也存在一些缺点如荧光素共轭体不稳定,荧光测试仪的强激光,使之发生不可逆转的光漂白,导致荧光信号的迅速下降。荧光素在水溶液中以离子形式存在,吸收及荧光性质易受pH值影响。与标记物共轭连接后,易发生猝灭。Rhodamine6G(555nm)RhodamineB(565nm)罗丹明染料分子呈刚性平面,有较高的荧光量子产率,故荧光较强,已成为商品化染料但位移较小,吸收区域的低能量部分与发射区的高能量部分重叠,导致染料的激发辐射损失。例二例三丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)是一种强荧光剂，可用于测定肽链的氨基末端，它能专一地与链N-端α-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定出N-端是何种氨基酸。溶于丙酮，苯，二恶烷等有机溶剂，不溶于水。DNS-Cl350nm/520nm对溶剂的极性敏感。一、蛋白质的活性功能团1、氨基（赖氨酸-氨基，N-末端-氨基）NH2(CH2)4CH(NH2)COOH赖氨酸所有的蛋白质和多肽都含有氨基，而且它们较易发生反应，所以通过氨基进行化学修饰是实现蛋白质标记的最常用的方法。2、巯基（胱氨酸、半胱氨酸）半胱氨酸的巯基的亲核性比氨基强，pH中性时反应活性很高。3、羧基、酚羟基羧基、酚羟基在水溶液中反应活性一般较低。标记过程利用蛋白质的活性功能团对蛋白质进行标记标记后不影响蛋白质的功能，标记后对荧光分子的荧光性质影响不大。NH2+FluNH2Flu1.Amine-ReactiveProbes

fluorescein-5-isothiocyanate(FITC'IsomerI')MolecularFormula:C21H11NO5S

MolecularWeight:389.38

二、标记蛋白质的有机荧光染料异硫氰基荧光素理想pH8~9fluorescein-6-isothiocyanate(FITC'IsomerII')MolecularFormula:C21H11NO5S

MolecularWeight:389.38

异硫氰基荧光素OregonGreen®488carboxylicacidMolecularFormula:C21H10F2O7

MolecularWeight:412.30

CASNumber/Name:N/A

RhodamineRed™-X,succinimidylesterMolecularFormula:C37H44N4O10S2

MolecularWeight:768.90

N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）理想pH9~9.54-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonylchloride(dabsylchloride)MolecularFormula:C14H14ClN3O2S

MolecularWeight:323.80

磺酰氯高活性基团，在水中不稳定，与许多基团（氨基，巯基，酚羟基，咪唑）反应，选着性差．TexasRed®sulfonylchlorideMolecularFormula:C31H29ClN2O6S2

MolecularWeight:625.15

Spectra—TexasRed-BSAconjugateAbsorptionandfluorescenceemissionspectraoftheTexasRedconjugateofbovineserumalbumin(A-23017)inpH7.0buffer.

Figure1.39Normalizedfluorescenceemissionspectraofgoatanti–mouseIgGantibodyconjugatesoffluorescein(FL),tetramethylrhodamine(TMR)andtheTexasRed(TR)dyes,shownbydashedlines(---),comparedtogoatanti–mouseIgGconjugatesofBODIPYFL,BODIPYTMRandBODIPYTRdyes,respectively,shownbysolidlines(—).

Figure1.23ComparisonofthefluorescencespectraoftheAlexaFluor680andCy5.5dyes.Spectrahavebeennormalizedtothesameintensityforcomparisonpurposes.

Cy3andCy5arereactivewater-solublefluorescentdyesofthecyaninedyefamily.（花青染料）1989

Cy3isexcitedmaximallyat550nmandemitsmaximallyat570

nm,inthegreenpartofthespectrum;quantumyieldinPBSbufferis0.04FW=766.Cy5isexcitedmaximallyat649nmandemitsmaximallyat670

nm,inthefarredpartofthespectrum;quantumyieldis0.28.FW=792.Theyarealsousedtolabelproteinsandnucleicacidforvariousstudies.标记方法碳二亚胺法：

碳二亚胺（R1N=C=NR2）能使羧基和氨基间脱水形成酰胺键。1—乙基—3（3—二甲氨丙基）碳二亚胺（EDC）是一种常用的水溶性碳二亚胺。混合酸酐法：

偶联物一方的羧基与氯甲酸异丁酯反应，形成混合酸酐。这是一种非常活泼的中间体，它能与氨基化合物反应形成酰胺键。

戊二醛法：戊二醛是一个双功能试剂，它的二个醛基能分别与标记化合物及被标记物的氨基形成Schiff键。

过碘酸法；

此法的必要条件是偶联物一方含糖，另一方含氨基。糖的羟基被氧化成醛基，然后与氨基作用形成Schiff键。

N—羟基琥珀亚胺活化法：不少抗原含有

羧基，可通过N—羟基琥珀酰亚胺活化，在与氨基化合物偶联。

琥珀酸酐法：

偶联物一方的羟基与琥珀酸酐反应，得到一个琥珀酸半酯，通过这个带羧基的中间体，与氨基形成酰胺键。

O—（羧甲基）羟胺法：

抗原的酮基（或引进的酮基）与O—（羧甲基）羟胺反应，产生O—羧甲肟衍生物，这个中间产物的羧基与另一化合物的氨基结合。

重氮化法；芳香胺的重氮盐能以蛋白质的酪氨酸残基上的酚羟基的邻位反应，形成偶氮化合物。

2.Thiol-ReactiveProbesInproteins,thiolgroups(alsocalledmercaptansorsulfhydryls)arepresentincysteineresidues.Thiolscanalsobegeneratedbyselectivelyreducingcystinedisulfideswithreagentssuchasdithiothreitol.

StructuralcomparisonofthereducingagentsDTTandTCEP.UnlikeDTT(dithiothreitol,D1532),TCEP(tris-(2-carboxyethyl)phosphine,hydrochloride;T2556)doesnotcontainafreethiol,andthereforemaynotrequireremovalbeforereactionwithathiol-reactiveprobe.

Reactionofathiolwithanalkylhalide.

Reactionofathiolwithamaleimide(顺丁烯二酰亚胺).

标记纳米粒子三、核酸的荧光分析标记寡核苷酸分子灯标（MolecularBeacon）1996年,SanjayTyagi等设计了一种可以特异识别核酸序列的新型荧光探针,这种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化而发出荧光,他们将其命名为分子信标(MolecularBeacon)。分子信标因其具有背景信号低,灵敏度高、特异性识别性强、操作简单以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点,在短短的几年内得到了迅速的发展,并已广泛地应用于实时监测聚合酶链反应、基因突变的快速分析、DNA、RNA的检测、DNA/RNA杂交的动力学研究以及DNA/蛋白质相互作用研究等,其应用领域仍在不断拓展。分子灯标（MolecularBeacon）是一种由寡聚核酸形成的发夹型分子。它包括一个环(loop)干(茎stem)结构,其中环由与靶分子互补的核酸碱基序列组成,一般有15～20个碱基;干为两列互补的碱基序列,一般是5～7个碱基对。分子信标之所以能通过构象改变而发荧光是基于它内在的环茎结构和荧光标记特征:在分子信标中,荧光基团共价地连接在其干部分的一个末端,猝灭基团也靠共价键连接在干部分的另一末端。分子信标未与靶分子结合时,由于干部分两列互补碱基对之间的氢键连接,使得荧光基团与猝灭基团距离很近,荧光基团将能量转移给猝灭基团而发生荧光猝灭;当分子信标与序列互补的靶分子结合时,环与靶序列杂交而形成了比干部分更长更稳定的碱基对氢键连接,分子信标发生构型的变化,干部分被打开,从而使荧光基团远离猝灭基团,荧光基团产生的荧光得到恢复。分子信标这一荧光信号传导机制是基于荧光能量转移基础上的。当两个基团的距离在1～10nm,且能量给体(荧光基团)的发射光谱与能量受体(猝灭基团)的吸收光谱有较大程度的重叠时,则可发生荧光共振能量转移。4，4′-二甲基胺基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)可作为分子信标通用的猝灭基团,它对多种发射光谱不同的荧光基团都有很好的猝灭作用。非标记的嵌插性核酸探针溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用Polaroid底片或带CCD成像头的凝胶成像处理系统拍摄。溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带。

溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！SYBRGreenI和溴化乙啶（EB）Ames测试结果显示EB容易引起有机体突变。(Singeretal.,Mutat.Res.199,439:37-47.)溴化乙锭的毒性实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。四、荧光纳米粒子二氧化硅荧光纳米粒子二氧化硅本身不具有荧光，可以通过包埋或掺杂的方法制备具有荧光的以二氧化硅为基质的纳米粒子。优点：1、二氧化硅具有水溶性；2、当溶剂发生变化时，粒径不变（不溶胀）；3、二氧化硅透明，发射、激发光透过不受影响；4、二氧化硅纳米粒子中染料的荧光性质保持不变；5、二氧化硅具有生物兼容性，且易修饰、标记；6、二氧化硅基质对染料起到了阻止与外界氧分子的直接接触，防止了染料的光漂白，因此具有很好的光稳定性Acrylamide＊Mlecularprobe＊ReferenceDye＊DextranLiquidPolymer(PVCorDecylethacrylate)＊Lonophore＆indicator＊PEGSol-Gel＊Enzyme＊ReferenceDye＊PEGIonH+BoundTargetslonophoreFluorescentIndicatorEnzymeSensitizingDyeTargetingAborPeptideIonicAdditivehhhPEBBLE示意图PEBBLE常用基质量子点量子点荧光半导体材料中，微小晶体通常被称作量子点（quantumdot)。这种量子点可以把电子锁定在一个非常微小的三维空间内，当有一束光照射上去的时候电子会受到激发跳跃到更高的能级。当这些电子回到原来较低的能级的时候，会发射出波长一定的光束。现在量子点被大量地应用在生物学实验室内，帮助研究人员确定生物细胞的结构或活动。当量子点被光脉冲照射的时候会产生各种各样的颜色，不太高级的光学显微镜就可以观察到这种彩色光。如果把量子点附着在需要研究的对象上，研究人员就可以了解物质的活动。不但如此，量子点还可以用来追踪药物在体内的活动、或是研究患者体内细胞和组织的结构。量子点可以产生多种颜色的光，光的颜色取决于量子点的尺寸。研究人员已经制造出可以产生超过12种颜色荧光的量子点，而且理论上讲可以产生出更多的颜色。这样，当某个波长的激光对多种量子点进行照射激发的时候，可以同时观察到多个颜色，同时进行多个测量。生物研究中所使用的量子点需要覆盖上一层物质以便可以追踪特定的生物分子，可以应用在医学成像技术中。国外的科学家已经应用量子点标记肿瘤细胞凭借活体成像系统进行相关的研究

量子点(QuantumDots，QDs)，也称半导体纳米微晶体(SemiconductorNanocrystal，NCs)，是一种零维的纳米材料。主要由II-VI族元素和III-V族元素组成，其直径通常在几到十几纳米之间。量子点概述目前研究较多的是CdTe、CdSe、CdS、ZnS等量子点。

量子点具有许多体相材料和分子级别的材料所没有的性质，即量子效应，表现在以下几个方面：宏观量子隧道效应量子效应表面效应小尺寸效应量子尺寸效应介电限域效应量子点的量子效应量子点的光学性