一DNA的生物合成

第一节DNA生物合成的基本规律第二节DNA的生物合成第三节DNA的损伤与修复第四节DNA重组本章重点与难点重点：DNA复制的基本过程。难点：DNA的半保留复制、半不连续复制。DNA的核苷酸顺序信息编码着细胞RNA和蛋白质的一级结构，并通过酶影响所有细胞成分的合成，决定各种生物的大小、形状和功能。DNA在生物大分子中占有中心的位置大肠杆菌遗传图第一节DNA复制的一般原理复制的方式—半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)

需要引物(primer)一、DNA复制是半保留复制(semi-conservativereplication)概念：DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基互补配对原则（A:T,G:C），由DNA聚合酶催化合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链来自亲代，另一股单链则是新合成的。两个子代DNA和亲代DNA碱基序列完全一致。这种复制方式称为半保留复制。

DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson

和F.Stahl所完成的用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验所证明。DNA半保留复制的实验依据按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性，是生物保持遗传稳定性的基础。半保留复制的意义原核生物复制时，DNA从原点

(复制的起始点，origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉(replicationforks)，称为双向复制。

二.DNA复制是固定起点的双向复制DNA复制的方式大肠杆菌环状

DNA复制时所形成的θ结构起始点oriC复制叉的推进复制叉起始点，原点(O)，富含AT,产生瞬时单链起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’复制子真核生物每个染色体有多个复制原点，习惯上把两个相邻复制原点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是能够独立完成复制的功能单位。真核生物是多复制子的复制。三.DNA复制是半不连续复制3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)先导链连续复制而随后链不连续复制，称为半不连续复制或复制的半不连续性。四.需要引物DNA聚合酶不能从头合成一段新链，参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’-端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。

第二节DNA的生物合成一、合成的反应通式及反应方向目录DNA聚合酶反应通式：

(dNMP)n

+

dNTP→(dNMP)n+1

+

PPi

反应方向：5’3’参与DNA复制的物质底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DDDP或DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白质因子二、原核生物参与DNA聚合反应的酶类及蛋白质（DNA复制酶系统）一）DNA聚合酶二）拓扑异构酶(topoisomerase)三）DNA解链酶(DNAhelicase)四）引物酶(peimase)和引发体(primosome)五）DNA连接酶（DNAligase）六）单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)一）DNA聚合酶全称：DNA依赖的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol功能：DNA聚合酶活性，合成DNA链。

DNA外切酶活性，DNA错配后的修复，或切去RNA引物。5´CGCTTCAGGATA3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´

35外切酶活性

53外切酶活性?能切除突变的DNA片段和RNA引物。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性目录原核生物的DNA聚合酶大肠杆菌中相继发现了三种主要的DNA聚合酶：DNA-polⅠ：5’-3’聚合酶活性，DNA合成。3’-5’外切酶活性，错配修复。5’-3’外切酶活性，在细胞DNA复制、重组和修复中起到修缮工的作用。DNA-polⅡ：表现出高度专一于DNA损伤修复功能。DNA-polⅢ：是大肠杆菌DNA复制中主要的酶。编辑校对DNA的主要复制酶参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物、填补空隙功能2040400分子数/细胞≥10≥4个1亚基数--+5外切酶活性+++5外切酶活性+++5聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶多聚化速度（核苷酸/秒）16-20反应速度慢持续性低40250-1000DNA-polⅢ：由十种亚基22个组分构成，其中α、ε、θ3个亚基组成核心酶，α亚基具有5‘→3’聚合DNA的酶活性；而ε亚基具有3‘→5’外切酶的活性，与DNA复制的校正功能有关，θ亚基可能与核心酶的组装有关。每个亚基至少有一个拷贝。2个β亚基构成滑动钳蛋白，帮助核心酶与模板结合。其它多个亚基组成滑动钳装载复合物。DNA聚合酶Ⅲ全酶二）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

又称DNA松弛酶（DNA-relaxingenzyme)，简称Top，是一类催化同一DNA分子中不同超螺旋状态之间转变的酶。10

8局部解链后作用特点：既能水解、又能连接磷酸二酯键分类：拓扑异构酶Ⅰ:切断DNA中的一条链，使DNA旋转,减少负超螺旋，再将切断的单链连接起来。拓扑异构酶Ⅱ:可以切断DNA的两条链,引入负超螺旋。需消耗ATP.三）解链酶（unwindingenzyme），又称解螺旋酶。用于解开DNA双链，使埋藏在DNA双螺旋分子中的碱基对暴露出来作为模板以合成新链。每解开一对碱基间的氢键，需消耗两分子ATP。大多数解螺旋酶与随后链模板DNA结合后沿5‘-3’运动。四）引发酶(primase)又称引物合成酶：催化前导链和随后链冈崎片段引物的合成。引发酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3‘-OH，使子代DNA链能够开始聚合。与另外的6种蛋白质组成引发体（primosome）才起作用。五）DNA连接酶催化一个DNA链的3-OH末端和相邻DNA链的5-磷酸末端之间的连接，形成共价磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整链的酶。DNA连接酶连接碱基互补双链中的单链缺口，不能催化两条游离DNA链相连；只能催化两条多核苷酸链连接，不能催化单核苷酸的延长。在复制、修复、重组及剪接中起最后缺口缝合的作用。DNA连接酶催化的条件是：①未封闭的缺口位于双链DNA中，其中有一条链是完整的；②需一段DNA片段具有3’-OH，而另一段DNA片段具有5’-Pi基；③

需要消耗能量。六）单链结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。作用：①

稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②

保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

一）复制的起始1.复制起始于原点oriC：E.coli复制起始点oriC结构由245个高度保守的碱基对组成，由3个13bp的重复顺序和4个9bp的重复顺序组成的保守序列，富含A、T。三、原核生物的DNA生物合成

三个阶段：起始、延伸和终止。GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列/交感顺序共有序列/交感顺序TTATCCACA

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列2.DNA复制的起始过程预引发：参与打开原点的预引发复合物（起始复合物）由至少9个不同的蛋白质和酶组成。DnaA：大约20个，结合于原点的9bp重复序列，识别并变性原点13bp重复序列。DnaB(解螺旋酶):在DnaC参与下与局部解链的单链结合，沿解链方向继续移动，解开足够用于复制的长度，并逐步置换出DnaA

，形成两条单链DNA，创造两个潜在的复制叉。DnaADnaB(解螺旋酶)SSB单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。拓扑异构酶使DNA的超螺旋解开。引发：引物酶和解链模板上的DnaB

、DnaC蛋白，DNA复制起始区域结合成复合物引发体，在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子

引物3'HO5'引发酶二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。延长是指前导链和滞后链的合成。

1.聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以亲代DNA链为模板，从5’→3’方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延长随从链)和δ（延长领头链）。顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为先导链或领头链(leadingstrand)。随从链的合成另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随后链或随从链(laggingstrand)。复制中的不连续片段（约1000个核苷酸）称为冈崎片段(okazakifragments，1968)。

冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。2.链的延长：DNA聚合酶Ⅲ加入到引发体上，形成复制体，同时进行先导链和随后链的合成。随后链的合成不断需要引物，引物酶合成引物，DNA聚合酶Ⅲ合成新的冈崎片段。3.前导链和随后链协同合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引发体引发体解旋酶解旋酶4.去除引物，填补缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。5.连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

3‘5‘3‘5‘OHP原核生物基因是环状DNA，大肠杆菌双向复制的片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli

ori

terSV40三）复制的终止

在ter区内存在７个ter序列（terA到terE），富含ＧＴ。其中terA、terＤ、terE位于复制叉汇合点的一侧，terＣ、terＢ、terＦ、terＧ位于复制叉汇合点的另一侧，它们分别是两个复制叉终止的特异位点。每个复制叉必须越过另一个复制叉的终止位点才能到达自己的终止位点。Tus蛋白是解链酶的抑制剂，与ter位点结合终止复制。

DNA复制终止于ter区陷井区是终点利用物质（Tus）的结合部位。Tus可以和每一个ter结合。一旦形成Tus-ter复合物，就可以通过阻止解旋酶解旋DNA来封闭复制叉的通路。Tus-ter复合物只捕获来自一个方向（顺时针或反时针）的复制叉。DNA分配和细胞分裂期DNA合成期G1G2SM四、真核生物的DNA生物合成

•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。

合成机制与原核生物基本一致。间期间期复制所需蛋白质的合成•多起点的双向复制：真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。果蝇最大的染色体至少有３０００个复制起点。•催化ＤＮＡ合成的DNA-pol不同。1、真核生物复制特点２．真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

具有引物酶活性和聚合酶活性，起始引发合成RNA引物及随后链的复制。DNA-pol

ＤＮＡ修复作用。DNA-pol

线粒体DNA聚合酶。DNA-pol

具有聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。前导链和随后链的复制。DNA-polε聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶至少有５种：第四节DNA损伤与修复DNADamageandRepair由于一些物理、化学或生物学因素的作用，或者由于生物体DNA复制过程出现异常均可引起DNA分子的损伤或改变。DNA核苷酸顺序的永久性改变称为突变。一、突变的意义1、突变是进化、分化的分子基础2、突变导致基因型改变3、突变导致死亡4、突变是某些疾病的发病基础生物进化中突变是与遗传相对立统一而普遍存在的现象。二、DNA损伤导致突变的几种形式点突变：一个或少数几个碱基的改变。插入突变：增加一个碱基对或多个碱基对的突变。缺失突变：缺失一个碱基对或多个碱基对的突变。倒位或转位：DNA链重组使其中一段序列方向倒置、或从一处迁移到另一处。双链断裂:会导致细胞死亡。沉默突变：即同义突变，突变虽然替换了碱基，但氨基酸顺序未变，保持野生型的功能。

回复突变：突变能克服第一次突变造成的影响。如点突变和插入突变往往是可逆的。镰刀形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

·

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·

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·

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·

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·

·

·

·

·

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C肽链CTCGAG基因谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突变三、引发突变的因素物理因素（紫外线(ultraviolet,UV)、电离辐射）和化学因素（化学诱变剂）等都能引起生物突变和致死。UV化学因素四、DNA损伤的修复修复(repairing)：是对已发生分子改变的补偿措施，使DNA恢复为正常的结构和功能。一个普通哺乳动物基因组在24小时之内可以积累成千上万个DNA损伤，DNA修复系统的存在，避免了这种损伤对生命可能造成的巨大威胁。DNA修复系统具有多样性，修复之所以成为可能，是因为DNA由两条互补的双链组成，当一条链损伤时，可以以另一条链做模板。一）在E.coli中存在6种基本的修复系统1.光修复2.切除修复3.错配修复4.重组修复5.差错倾向修复（SOS修复）1、光修复：紫外线可使DNA分子同一条链相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体，从而影响复制和转录。DNA光复活酶能特异性识别嘧啶二聚体并与之结合，经可见光照射后（波长约400nm）被激活，切除嘧啶二聚体间的c-c键，将二聚体分解为正常单体，酶从链上释放，DNA恢复正常结构。光复活酶(photolyase)

UV2.切除修复

碱基切除修复：

DNA糖基化酶是一个能识别DNA中由胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤分别脱氨形成的损伤，并除去受损伤的碱基。这样变型的碱基可以通过DNA糖基化酶切断N-C糖苷键除去，在DNA中制造了脱嘌呤或脱嘧啶的部位，通常将这样的部位称之AP位点。每种DNA糖基化酶通常对一种类型的碱基损伤特异。例如尿嘧啶糖基化酶就可以除去由于胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶，形成一个AP位点。然后一个称为AP内切核酸酶切去含有AP位点的脱氧核糖-5-磷酸，出现一个核苷酸空隙。然后在DNA聚合酶作用下重新放置一个正确的核苷酸，最后通过DNA连接酶将切口封闭。尿嘧啶糖基化酶系统的修复过程

核苷酸切除修复：

用以修复引起DNA双螺旋结构变形的大的DNA损伤。修复酶是由基因uvrA、uvrB和uvrC分别编码的三个亚基组成的，该酶又称为ABC核酸酶。首先ABC切除核酸酶从损伤部位的两侧切去含有损伤的DNA链，结果都出现一个单链缺口。然后在DNA聚合酶催化下按照互补链填充缺口，切口最后通过DNA连接酶连接。UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHPDNA连接酶ATP甲基指导的错配修复3.错配修复修复系统必须有一种区分模板链和新合成链的机制。细胞使用模板链的甲基化作用作为标签，使它们和新合成链区分。Dam甲基化酶甲基化所有含有GATC顺序中腺嘌呤N6的位置。靠近GATC顺序附近的错配可以根据已甲基化的模板链加以修复。切除的链可以长达离半甲基化的GATC顺序远至1000bp的错配碱基。错配可以通过E.coli中的3个蛋白质（MutS、MutH和MutL）校正。错配修复

4.重组修复

切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。重组修复至少需要4种酶组分。重组基因recA编码一种分