核移植技术与动物克隆

第五节

核移植技术与克隆技术主讲人：黄竹涛2015.4.19主要内容：细胞核移植技术

1）基本概念

2）核移植类型

3）核移植的一般操作程序

4）核移植的应用动物克隆1）克隆的基本原理2）影响克隆的因素3）体细胞克隆技术4）存在的问题一、核移植技术核移植技术：利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中（同种或异种动物的去核成熟卵细胞），使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育,使得核供体的基因得到完全复制，从而创造无性杂交生物新品种的一项技术。1-1.基本概念供体细胞核的来源体细胞核移植胚胎细胞核移植胚胎干细胞核移植供受体种间关系异种核移植同种核移植核移植目的生殖性克隆治疗性克隆1-2.核移植类型生殖性克隆治疗性克隆细胞治疗组织替代器官移植1-3.哺乳动物克隆操作技术生产克隆动物的主要方法有两种：

1）胚胎分割

2）细胞核移植（动物克隆主要方式）

核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、激活、重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步骤。核移植技术的一般操作程序1)核供体细胞的准备在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。

供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。

2)核受体细胞的准备

去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。

卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的MⅡ卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。去核方法：

1）Hochest染色法

2）时间控制去核法

3）化学去核法

4）2.5%蔗糖处理去核

5）末期去核法6）盲吸去核法3)细胞核移植

常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质内注射是用一个外径5～8μm的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。4）细胞核融合经透明带下细胞核移植操作的卵子需要进行融合处理，才能使供体核进入受体胞质中，形成重构卵。

方法：化学融合——聚乙二醇处理仙台病毒融合电融合——外加脉冲电场5)激活卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态。电激法化学试剂法6）重组胚的体外培养

经融合和激活的重组胚体外培养，观察重组胚的发育率。

7）胚胎移植

重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。1-4.核移植技术的应用异种器官移植

可移植器官短缺猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近

急性免疫排斥反应基因敲除半乳糖基转移酶核移植基因敲除SPF克隆猪器官移植生产药用蛋白目的基因

转基因细胞系核移植动物乳腺

乳液提取目的产

物基因打靶

保护濒危物种细胞核去核卵母细胞核移植重构胚1)成功率低2)理论研究相对滞后3)体细胞克隆后代可能出现早衰，老化4)技术不够完善1-5.核移植技术存在的问题2-1.克隆基本概念与原理

2-1.克隆基本概念与原理发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。2-2.影响哺乳动物克隆效果因素1.供受体细胞的同期处理2.受体细胞的因素

3.供体细胞的因素

4.重构胚激活因素、怀孕及其维持1.供受体细胞的同期处理M期（分裂期）：噻氨酯达唑或乙酰甲基秋水仙碱；G1期（DNA复制前期）：抑制DNA合成的药物，如：阿菲迪霉素、羟基脲；G2期（DNA复制期）：放线菌酮；G0期诱导：血清饥饿法。

细胞周期对核移植成功率的影响至关重要。“多莉”诞生以后，其研究者认为，成功的关键因素之一是供体细胞经血清饥饿后，处于GO期，认为这种细胞易于重编程。

G0期：指具有分裂能力的组织中的细胞在反复分裂数次之后，处于停止分裂状态的时期。供受体细胞所处的时期：对于受体细胞而言，其所处的阶段对核移植后重构胚的发育至关重要；对于供体细胞而言，不同动物不同时期的胚胎具有不同的分化潜能，但是，如果核供体超过囊胚阶段，则会影响重组胚的发育，如果超过了囊胚后期，则更多的细胞会发生不可逆的分化。

2.供体细胞核选择的因素：（1）细胞类型：

KatoY等比较了牛同一个体卵母细胞和输卵管细胞及不同个体体细胞：肝细胞、耳细胞、子宫细胞、表皮细胞、输卵管细胞及卵母细胞对克隆效果的影响，结果认为牛卵丘／颗粒细胞和输卵管细胞最适用于牛的核移植。（2）细胞传代次数：细胞的传代是否利于克隆个体方面的说法不一。但是大多数研究者使用的是原代培养或短期培养的细胞，认为这类细胞利于核移植胚的发育。

3.受体细胞的因素：

（1）盲吸去核法通常，盲吸法去核的时间选择在第一极体刚排出时，因随时间延长卵细胞核远离第一极体，影响去核效率。此外，不同动物卵母细胞的结构特点不同，其盲吸法的去核效率也不同。

（2）化学诱导去核法与盲吸法等建立在显微操作系统基础之上的机械去核法相比，化学去核法程序简单、机械损伤小、胞质丢失少、重复性好、适合大规模卵母细胞去核，具有很乐观的应用前景。

卵母细胞要求完全去核，否则会形成多倍体影响发育。（3）MPF的作用

MPF（促卵成熟因子）是通过卵成熟诱发物质的作用在卵细胞质内所产生的因子，可促使卵核胞破坏实现卵成熟过程。将正在成熟的卵细胞质注射到未成熟的卵时，可看到被注射的卵被诱发成熟。通过卵成熟诱发物质所产生的少量促卵成熟因子在卵内广泛增加，在到达一定浓度时，便引起卵母细胞成熟。卵细胞质中促卵成熟因子不具有特异性，所以可认为是普遍的细胞分裂开始的重要因子。卵母细胞的活化程度将影响胚胎的进一步发育，只有完全活化才能发育。

4.重构胚激活因素、怀孕及其维持：重构胚的激活是体细胞克隆技术的关键环节，体细胞克隆胚胎的充分激活是保证胚胎正常发育的先决条件，只有在去核卵母细胞充分激活的情况下才可以指导移人的核发生重编程。

可以通过将重组胚放在结扎羊的输卵管中培育一段时间的方法，或者在体外将其与输卵管上皮细胞培养的的方法来促使其激活并发育。注意移植重组胚的时间及维持其妊娠。生物学意义：1)提高动物无性繁殖能力：扩大优良品种，挽救濒危物种。2）促进对细胞核、细胞质与遗传关系的研究3）探索控制肿瘤细胞和癌细胞核的活动机理：研究其基因调控，为治疗提供依据。4）生物制药：活体药物工厂。CattleGoatsMicePigsGaurCatSheep1996199819981996200120002001克隆动物照片HorseDeerMulesRatsDog20032003200520032003体细胞克隆牛理论问题分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。2-3.克隆技术存在的问题实践问题克隆动