分子生物学人类基因组DNA提取等

人类基因组DNA提取限制性核酸内切酶切割的原理、方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用人类基因组DNA提取原理：DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。

为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。

哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似。

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。

这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。一.材料

一份提取总DNA的细胞或组织1.5ml、

微量离心管、微量移液器与吸头、15ml离心管、锥形瓶（500或1000ml）。二.设备

离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸水浴、透射紫外灯。仪器与试剂三.试剂1.细胞核裂解液(STE)：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA2.0.8%（W/V）标准琼脂糖；3.0.5×TBE缓冲液4.其他试剂：TE缓冲液或重蒸馏水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲液、溴化乙锭（EB）实验材料1.生理盐水2.1×细胞核裂解液（SET）：0.5ml

2mol/LTris-HClpH8.2，10ml

4mol/LNaCl，0.4ml

2mmol/LEDTA，加蒸馏水至100ml3.10%SDS：SDS10g，加水至100ml4.20mg/ml蛋白酶K5.Tris-饱和酚6.氯仿7.无水乙醇8.TE（缓冲系统）：10mol/LTris-HCl(PH8.0)，1mol/LEDTA(PH8.0)1.EDTA：钙离子络合剂，在分子生物学实验中是二价金属螯合剂，抑制核酸酶，降低细胞膜的稳定性；2.SDS（十二烷基硫酸钠）：是一种去污剂，破坏细

胞膜的脂质膜；3.蛋白酶K：一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白

质（包括糖蛋白和肽类）及脂类和胺类物质，但糖

蛋白的降解物常与DNA一同沉淀下来，干扰酶的活

性，消化后需要用酚、氯仿抽提纯化；4.酚：使蛋白质变性，将变性的蛋白质溶解在其中；5.氯仿：一种有效的蛋白变性剂，能促进两相的分离。DNA提取原则1.保证DNA结构的完整性2.纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质3.排除有机溶剂和金属离子的污染4.蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度5.排除其他核酸分子的污染四、操作步骤（酚法抽提染色体DNA）（一）DNA的提取

1.采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，12000r/min离心10分钟，倒掉上清；重复1次。2.沉淀中加1ml1×细胞核裂解液(STE)，混匀，再加350mlSTE和150ml10%SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10ml20mg/ml蛋白酶K，摇匀。37℃温箱过夜或50℃3～4小时。3.加等体积饱和酚，轻摇混匀10分钟，室温12000r/min离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。4.小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀5分钟，室温12000r/min离心5分钟。5.小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。6.将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2倍体积的无水乙醇，摇匀，静置10min，12000r/min离心10分钟，用新配制的70%乙醇洗两次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100mlTE缓冲液中，测OD（吸光度）值。7.TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置于70℃保存。电泳鉴定

取样品1μl、电泳缓冲液5μl、6×加样缓冲液1μl（含溴酚蓝和二甲苯青FF指示剂及甘油），混匀，在0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体λDNA作为标准。

DNA区带应比较集中，泳动速度与λDNA

相同或稍慢，证明分子量均>50kb。一般见不到泳动速度比溴酚蓝快的RNA区带。如果DNA不成区带，而是散开分布在λDNA与溴酚蓝之间，则说明DNA已经被降解成小分子。基因组DNA提取的意义基因组DNA含有细胞中全部的遗传信息，提取DNA是遗传性疾病，胎儿产前无创伤诊断，肿瘤和传染性疾病早期确诊的重要手段和技术。DNA提取的质量和产量直接影响PCR扩增，分子克隆，限制性内切酶酶切反应是否成功。限制性核酸内切酶识别及切割位点

限制性核酸内切酶只能识别特殊的碱基序列，作用于切断相邻碱基之间的磷酸二酯键；通常切割4～6个碱基对、具有回文序列的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性末端。

如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端：

5’GAATTC3’3’CTTAAG5’

AATTC3’G5’

5’

G3’CTTAA

5’5’

结果有两种情况：1.暴露出一段碱基序列，我们称之为粘性末端，如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端。2.有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端,如SmaⅠ5́-CCCGGG-3́5́-CCCGGG-3́3́-GGGCCC-5́3́-GGGCCC-5́琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳速度有差异而分离，这种技术是基因操作中常用的一种方法。

与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶电泳的应用（1）适合分离大片段DNA。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝