《发酵工程》第2章 菌种与种子扩大培养

第二章菌种与种子扩大培养

掌握微生物工业对菌种的要求、了解其常用微生物工业生产用菌种的来源掌握生产菌种的保藏、选育方法及防止菌种衰退的措施了解种子扩大的任务

掌握工业微生物的培养类型

了解影响种子质量的主要因素

Contents(4学时)发酵工业用菌种

种子扩大培养

重点：菌种的选育、保藏方法，防止菌种衰退的措施以及影响种子质量的因素。种子扩大培养定义

难点：影响种子质量的因素。第一节发酵工业用菌种

发酵工业对菌种的要求工业上常用的微生物及来源生产用菌种的保藏及选育防止菌种衰退的措施一、发酵工业对菌种的要求

发酵工业用的菌种尽管多种多样，但作为大规模生产，对菌种选择要求如下：能在价格低廉的培养基上快速生长，大量合成目的产物

可以在要求不高，易于控制的培养条件下（糖浓度、温度、PH、溶解氧、渗透压等）迅速生长和发酵，以缩短发酵周期。天气炎热地区选择耐高温的菌种更为适宜根据代谢调控的要求，选择高产菌株，如营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株选择抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染噬菌体菌种纯，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性不能是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素等），以保证安全

二、工业上常用的微生物微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而用于大规模工业生产的不足100多种；微生物酶有近千种，而工业上用的不过40－50种。微生物具有巨大的潜力可挖掘。工业上常用菌种举例：常用的工业微生物菌种如下：细菌放线菌酵母菌霉菌

1、常用的细菌大肠杆菌应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。

乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作

枯草芽孢杆菌应用：生产淀粉酶2、酵母菌种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母红酵母、面包酵母应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪啤酒酵母红酵母面包酵母3、霉菌曲霉属应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶应用：酱油、酱类（淀粉酶）米曲霉应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲应用：生产甲叉丁二酸(又名衣康酸)

毛霉应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒黑根霉是真菌的一种,常利用它的糖化作用,比如甜酒曲中的主要菌种就是黑根霉!黑根霉的最适生长温度约为28℃，超过32℃不再生长青霉菌应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶4、放线菌种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素工业用菌种的来源购买如从菌种保藏机构或者其它研究机构购买：CGMCC(中国普通微生物菌种保藏管理中心),隶属中科院CMCC中国医学微生物菌种保藏管理中心赠送筛选复壮三、生产用菌种的保藏及选育（一）菌种保藏

1、目的：提高菌种存活率，减少菌种的变异，保持原来优良的生产性能。

2、原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。

保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。

（1）斜面保藏法：在4℃左右的冰箱保藏，每隔一定时间进行移植培养后再继续保藏，如此反复。优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长，传代多，菌种容易变异。适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌

3、菌种保藏的方法：斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。（2）矿物油保藏法将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后放于冰箱中保存。适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种（3）砂土管保藏法利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不适用。（4）真空冷冻干燥法先在菌悬液加入保护剂（如：脱脂牛奶、血清等）然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽干。

特点：它是菌种保藏中最有效的一种方法。保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。单使手续麻烦，需要一定的设备。

适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真菌保藏效果不佳。（5）其他保藏方法冷冻法：分低温冷冻（－20℃）与超低温冷冻（－196℃）两种。适用于细菌、真菌、病毒等的保藏蒸馏水保藏法：菌体在无营养条件条件下4~10℃较长时间保藏。适用于酵母菌、真菌等。琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子细菌的保藏曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保藏。适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。麦粒保藏法：麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然后将试管放于干燥器内，室温或4℃保藏。对于细菌和真菌效果都较好。不同菌种采用不同保藏方法，以便长期保藏:1、酵母菌一般采用定期移植斜面低温保藏法，将酵母接种子米曲汁或麦芽汁琼脂斜面上，放于低温处，每隔几个月移植一次。酒精酵母经过数十年的移植没有发现变异或衰退现象。也可采用石蜡油封藏法

2、曲霉过去采用定期移植斜面低温保藏法，但极易发生变异现象。产生柠檬酸的黑曲霉连续移植多次甚至不生成分生孢子或不产柠檬酸。而改用砂土保藏法后，变异现象不再发生3、丝状真菌特别是不产生孢子的担子菌，可采用液氮超低温冻结法保藏，但需专门的液氮冰箱4、一般细菌以冷冻干燥法保藏。乳酸菌可用麦壳保藏；丙酮丁醇梭菌，可用砂土管保藏。放线菌可用砂土管或冷冻保藏法保藏国内外菌种保藏机构菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种的保藏都极为重视。世界上有700多家菌菌种保藏机构，其中国际知识产权组织承认的法定的保藏机构仅有28家。1、我国的微生物菌种保藏机构2、国外主要的微生物菌种保藏机构

1）美国标准菌种收藏所（ATCC）2）美国冷泉港研究所（CSH）3）日本东京大学应用微生物研究所（IAM）4）日本东京科研化学有限公司（KCC）5）日本大阪发酵研究所（IFO）6）英国国立标准菌种收藏所（NCTC）7）美国国立卫生研究所（NIH）8）美国农业部北方开发利用研究部（NRRL）（二）菌种选育

菌种选育

是按照生产的要求，根据微生物的遗传和变异的理论，用人工方法使菌种变异，再经过筛选而达到菌种选育的目的。育种的目的:

改变菌种的特性，使产量提高、改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。微生物育种的基本方法包括以下几种类型:自然选育抗噬菌体菌株的选育诱变育种代谢调控育种基因定向育种

自然选育是指在生产过程中不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行的菌种筛选的过程。

诱变育种是采用物理、化学诱变因素使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误的DNA模板形成异常的遗传信息，造成某些蛋白结构变异，从而使细胞的功能发生改变。

微生物诱变育种的工作程序如下:

纯化

细胞或孢子悬液制备

中间培养突变株分离

初筛

复筛生产性试验

诱变剂处理离心收集菌体

离心洗涤玻璃珠振荡分散

过滤

原菌株（出发菌株）代谢控制育种主要有两个方面：一方面是改变代谢通路的育种，另一方面是改变代谢自动调节系统的育种。基因重组是杂交育种的基础，其方法多种多样，包括:有性杂交准性杂交转化和转导原生质体融合技术基因工程技术

四、防止菌种退化的措施

1、菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产品的得率降低区别于杂菌污染：

杂菌污染引起产量下降和影响菌种生长，容易和菌种退化相混淆，需通过划线分离来确定是污染还是衰退。2、菌种退化的原因：一、菌种保藏不妥；二、菌种生长的要求没有得到满足；

经诱变得来的突变株由于发生回复突变，也会丧失新的特性。3、防止菌种退化的方法：

做好菌种保藏以保持菌种的优良特性满足菌种生长要求，减少传代次数对已衰退的菌株进行分离、复壮4、菌种复壮方法①纯种分离法；②淘汰已衰退的个体③采用其它方法：诱变因素处理，再进行单菌落分离；选择合适的培养基

第二节种子扩大培养

种子扩大培养是指将保存在沙土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种经转接到试管斜面活化后，再经扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯培养物则称为种子。种子扩大培养的任务工业微生物的培养类型一、种子扩大培养的任务

◆任务：不仅要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的接种数量足够的培养物。以便在发酵罐的发酵培养过程中尽可能地缩短迟滞期。◆根据菌种生长速度快慢来决定扩大培养的级数；※细菌（谷氨酸及其它氨基酸生产）生长较快，用二级放大培养（斜面菌种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→发酵罐）※放线菌（生产抗生素）生长繁殖速度较慢，常常用三级种子扩大培养（其中链霉素须四级扩大）：即斜面菌种→一级种子摇床培养→二级（小）种子罐培养→三级（较大）种子罐培养→发酵罐，一般50吨发酵罐多采用三级发酵。有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵。二、工业微生物的培养类型

工业微生物的培养方法两大类型（1）静置培养法（厌气性发酵）例如：酒精、丙酮、丁醇、乳酸等发酵均属于此类型。

（2）通气培养法（好气性发酵）。例如；氨基酸、核苷酸、有机酸和酶制剂等发酵均属此类型。用作种子扩大培养的方法又可分为：液体培养法：三角瓶摇床振荡或回转式培养。

表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养，菌体生长在培养基表面。

固态培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等固体培养基（如麸皮）培养。大规模工业生产的培养方法及特点：园盘制曲机（园盘固体发酵机）A、固体培养（曲法培养）浅盘固体培养深层固体培养B、液体培养浅盘液体培养液体深层培养：

目前几乎所有的好气发酵均采用液体深层发酵法；C、载体培养：用天然（或人工）多孔材料（如脲脘泡沫塑料）代替麦麸之类固态基质作微生物生长的载体，营养成分可严格控制。D、两步法液体深层培养：在酶制剂和氨基酸生产中应用较多。控制菌体在不同生长期的条件。（营养生长与代谢产物积累时条件不同）操作：菌种先在营养丰富的培养基上大量繁殖→收集菌体浓缩物→洗涤→添加诱导物的产酶培养基中培养特点：将菌体生长条件（营养期）与产酶条件（自我繁殖期）区分开来。eg:

酶制剂两步法液体深层培养第一步是属有机酸发酵或氨基酸发酵。第二步是在微生物产生的某种酶作用下把第一步产物转化为所需的氨基酸所以又称为酶转化法，eg:氨基酸生产的两步法液体深层培养：工艺繁杂，目前谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸等大多数是利用直接发酵来生产的三、影响种子质量的主要因素1、培养基：主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。

选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。种子培养基是培养菌体的（以菌体增殖为主要目的），应该是糖份少而氮源多些。但种子罐与发酵罐培养基成分趋于一致时，可缩短发酵生产的周期，但在各成分的数量（原料配比上），应根据培养目的而定。2、种龄与接种量对数生长期为宜，种龄过嫩或过老，都会延长发酵周期，降低产量。一般以5~10%为宜。3、温度：温度直接影响生长和酶的合成

夹套、排管或蛇管，冬季进风还要加热

当公称容积在6M3以下时罐采用夹套式。发酵气的冷却或加热，均由夹套来完成。公称容积为6M3以上时，发酵气的冷却由立式排管来担负发酵罐内排管4、pH值：对