第八章微生物遗传

第八章微生物遗传第一节遗传的物质基础第二节质粒和转座子第三节诱发突变——Ams实验第四节微生物育种一.DNA作为遗传物质1.Griffith的转化试验（1928年）2.3.二.RNA作为遗传物质一.质粒

一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb（细菌质粒多在10kb以内）。1.质粒的分子结构通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中，也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒。2.质粒的分离碱提取法：①菌体的培养和收集：一般采用丰富培养基对菌体进行培养，当细胞生长到指数期后期时，离心收集细胞。②溶菌：一般用溶菌酶去壁以形成原生质体或原生质球。③碱变性处理：在SDS等表面活性剂存在下加NaOH液使pH升至12.4，可使菌体蛋白质、染色体DNA以及质粒DNA变性。④质粒复性：加入pH4.8的KAc-HAc缓冲液，将提取液调至中性，由于质粒分子量小而容易复性，并稳定存在于溶液中；染色体DNA分子量太大，在复性过程中形成DNA之间的交联导致其形成更大分子的不溶性物质。⑤离心分离：经高速离心可以使细胞碎片和已变性的菌体蛋白及染色体DNA一起沉淀3.质粒的特性（1）位于核基因组外，以cccDNA方式存在；（2）有的质粒可整合到核染色体上；（3）可重组（质粒与质粒间，质粒与染色体间）；（4）人为消除（高温、丫叮类，UV，电离辐射，利福平等）；（5）有的质粒可在细胞间转移（F因子，R因子）（6）质粒具有不亲和性质粒的不亲和性（plasmidincompatibility），

有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。4.质粒的主要类型根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应分类:致育因子（Fertilityfactor，F因子）抗性质粒（Resistancefactor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒（virulenceplasmid）代谢质粒（Metabolicplasmid）隐秘质粒（crypticplasmid）(1)致育因子(Fertilityfactor，F因子)又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。在志贺氏菌属（Shigella）、沙门氏菌属（Salmonella）和链球菌属（Streptococcus）等其他细菌中也发现了与大肠杆菌类似的致育因子。在放线菌中，天蓝色链霉菌含有SCP1和SCP2两种致育质粒，这两种质粒在天蓝色链霉菌的接合过程中起重要作用，带动染色体从供体细胞向受体细胞转移。(2)抗性因子（Resistancefactor，R因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（mercuricion，mer）四环素（tetracycline，tet）链霉素(Streptomycin,str)、磺胺(Sulfonamide,sul)、氯霉素(Chlorampenicol,cml)夫西地酸（fusidicacid，fus）负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。有的质粒可携带多达10种抗生素的基因。抗性质粒可以在关系相近或关系疏远的菌种间转移。(3)Col质粒：产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）细菌素结构基因、涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质的基因、赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。细菌素：许多细菌都能产生某些代谢产物，抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株，因为这些代谢产物是由质粒编码的蛋白质，不象抗生素那样具有很广的杀菌谱，所以称为细菌素（bacteriiocin）细菌素种类很多,一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。此外还有枯草杆菌素、乳酸菌素、根瘤菌素等。由G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与colicins有所不同，但通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。大肠杆菌素产自大肠杆菌的一种蛋白质，具有专一性地杀死其亲缘关系很近的、不具Col质粒的其它肠道细菌的功能。(4)毒性质粒（virulenceplasmid）许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。苏云金杆菌含有编码δ内毒素(伴孢晶体中)的质粒根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子(5)

代谢质粒（Metabolicplasmid）

质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。降解质粒：能将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。如TOL质粒：含分解甲苯的基因；CAM-OCT质粒：含分解樟脑辛烷的基因假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药(二氯苯氧基乙酸)、辛烷和樟脑等的能力。根据拷贝数或复制特点，质粒可分为：高拷贝数(highcopynumber)质粒（每个细胞中可以有10~100个拷贝,其复制和染色体的复制不同步）如ColE1、ColE2等

———————松弛型质粒(relaxedplasmid)低拷贝数(lowcopynumber)质粒（每个细胞中只有1~2个拷贝,其复制行为与染色体的复制同步）如F因子，R100

———————严谨型质粒(stringentplasmid)窄宿主范围质粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）广宿主范围质粒(broadhostrangeplasmid)（可以在许多种细菌中复制）二.转座因子细胞中能改变自身位置的一段DNA称为转座因子。原核生物的转座因子包括插入序列、转座子和某些特殊病毒。（一）转座因子的种类

1.插入序列（insertionsequence）IRTransposaseGeneIR①二个分离的反向末端重复序列

(invertedterminalrepeats,ITR)②一个转座酶（transposase)编码基因2.转座子①复合转座子——Ⅰ类转座子由IS类转座组件构成的复合体。组成：两端为IS，中间编码抗生素物质②复杂转座子——Ⅱ类转座子（TnA家族）

携带转座和耐药等基因的独立体家族。组成：两端为ITR，而不是IS，中间编码区含转座酶编码基因，及抗生素抗性和解离酶等编码基因。IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座因子的遗传学效应1.插入突变插到某一基因中，导致该基因突变插到操纵子前半段，引起极性突变插入抗性基因引起抗性突变2.染色体畸变3.基因的移动和重排一.诱发突变

自发突变的频率是很低的，一般为10－6-10-10。许多化学、物理和生物因子能够提高其突变频率，将这些能使突变频率提高到自发突变水平以上的物理、化学和生物因子称为诱变剂。

已知的化学致变剂和物理致变剂

物理致变剂

致变剂

电离辐射、紫外辐射等

化学致变剂脱氨剂、烷化剂、

大型加合物供体、碱基类似物、 插入剂、交联剂。诱变剂导致表型改变——营养缺陷型营养缺陷型：野生型菌株经诱变处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基上生长，这类突变菌株就是营养缺陷型。基本培养基：仅能满足野生型菌株生长需要的最低成分组合的培养基。完全培养基：可满足营养缺陷型菌株营养需要的培养基。二.诱变剂与致癌物——Ames试验埃姆斯实验1.鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型2.基本培养基3.鼠肝匀浆4.可疑“三致”样品实验步骤1.用基本培养基到平板2.将鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型培养液涂在平板上3.将“三致”样品和鼠肝匀浆混合吸附在滤纸片上，放在平板中央。4.培养2天后看结果。阳性结果阴性结果诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。

诱变育种的实践意义：当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。

1.选择选择合适的出发菌株2.制备待处理的菌悬液3.诱变处理4.筛选5.保藏和扩大试验诱变育种的基本过程出发菌株———用来育种处理的起始菌株

出发菌株应具备：

①对诱变剂的敏感性高；

②具有特定生产性状的能力或潜力；

出发菌株的来源；

①自然界直接分离到的野生型菌株：

②历经生产考验的菌株：

③已经历多次育种处理的菌株。1.出发菌株的选择要求：

①菌体处于对数生长期

②细胞分散且为单细胞

方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐温80（表面活性剂）

③用无菌脱脂棉过滤。

制备：

物理诱变剂——生理盐水（0.85%NaCl)

化学诱变剂——缓冲液

浓度：

细菌、放线菌108个/ml，霉菌、酵母菌106个/ml2.制备细胞悬液选择合适的诱变剂量：

不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。—致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：

产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70～80%）。3.诱变处理选择诱变剂的种类：在同样效果下，应选用最方便的因素；在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。（1）筛选方案：初筛：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；——因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。复筛：确认符合要求的菌株；——复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.4.菌种筛选①温度敏感突变株筛选方法：影印法用途：常用于提高代谢物产量原因：是由于某一酶蛋白结构改变后，在高温下活力丧失（2）突变株筛选举例由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌