紫外-可见分光光度法

第七章紫外-可见分光光度法◆学习目标⊙◆知识要求⊙◆能力要求⊙◆知识要求1．掌握光的吸收定律概念、表达式及条件，吸光系数和吸收光谱的意义，常用定量分析方法的原理和应用。2．熟悉紫外-可见分光光度计的基本结构、吸光度测量条件的选择、偏离光的吸收定律的主要因素。3．了解光谱分析法的分类、紫外-可见吸收光谱的产生机制、定性分析的依据和方法。案例导入

在夏天参加户外活动时，如果天气晴朗，就应该注意保护皮肤，否则，暴露在火辣辣太阳之下的皮肤，数小时后就会出现红肿、瘙痒、发热、刺痛症状，数日后出现蜕皮现象，这表明太阳光中有一种光线能伤害生物细胞。科学家研究证实，这种光线是紫外线。

根据可见光、紫外光与物质分子的相互作用建立了紫外-可见分光光度法。

根据待测物质（原子或分子）发射或吸收的电磁辐射，以及待测物质与电磁辐射的相互作用而建立起来的定性、定量和结构分析方法，统称为光学分析法。利用光谱进行定性、定量和结构分析的方法称为光谱分析法，简称光谱法。

紫外-可见分光光度法：研究物质在紫外-可见光区（200~760nm）分子吸收光谱的光谱分析法第一节概述1．电磁辐射（电磁波，光）：以巨大速度通过空间，不需要任何物质作为传播媒介的粒子流。

波长范围：紫外区200-400nm可见光区400-760nm一、物质对光的选择性吸收电磁辐射的性质：具有波、粒二象性波动性：粒子性：第一节概述单色光:

单一波长的光束复色光:

含有多种波长的光束电磁波谱:

以波长大小顺序排列的电磁波谱图波长10pm300pm200nm400nm800nm500mm1cm1m光谱射线X射线紫外光可见光红外光微波无线电波方法

光谱法分光光度法光谱法核磁共振可见光第一节概述红光与绿光互补、紫光与黄光互补，等等。

白光的组成白光的色散单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿青蓝橙红青一、物质对光的选择性吸收物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光第一节概述二、透光率与吸光度I0＝Ia+It+Ir

I0＝Ia+It

第一节概述透射光强度It与入射光强度I0的比值称为透光率或透光度T透光率的负对数为吸光度A

【例题9-2】（1）透光率T为50%，其吸光度A为多少？（2）吸光度A为0.70，其透光率T为多少？解:（1）透光率T=50%=0.50,其吸光度为：A=-lgT=-lg0.50=0.30(2）吸光度A=0.70,其够光率为：T=10-A=10-0.70=0.20=20%或0.70=-lgTlgT=-0.70,T=0.20第一节概述三、吸收光谱曲线

概念：以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标所描绘的曲线，称为吸收光谱曲线，简称吸收光谱。特点：在相同条件下，同一物质的不同浓度的溶液，其吸收光谱曲线相似，且λmax相同。这是定性分析的基础。UV-Vis吸收光谱的常见术语吸收峰→max谷→min肩峰→sh末端吸收:吸收光谱曲线波长最短的一段，吸光度相当大，但不成峰的部分。强带：吸光度大于104的吸收峰弱带：吸光度小于103的吸收峰特征值→定性依据第一节概述吸收光谱曲线示意图A480520560nmmax=515第一节概述四、紫外-可见分光光度的特点课堂活动1．紫外-可见光的波长范围是

A．200~400nmB．400~760nmC．200~760nmD．360~800nm2．下列叙述错误的是A．光的能量与其波长成反比B．有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈C．物质对光的吸收有选择性D．光的能量与其频率成反比第一节概述课堂活动3．紫外-可见分光光度法属于A．原子发射光谱法B．原子吸收光谱法

C．分子发射光谱法D．分子吸收光谱法4．分子吸收可见-紫外光后，可发生哪种类型的（）分子能级跃迁A．转动能级跃迁B．振动能级跃迁

C．电子能级跃迁D．以上都能发生

第一节概述第一节概述点滴积累1．光的本质是电磁波；物质对光的吸收具有选择性。2．吸光度与透光率的关系是:3．吸收曲线是溶液在一定条件下的吸光度随入射光波长变化而变化的曲线。

二、Lambert-Beer定律I0Itl光的吸收定律A＝-lgT=lg（I0/It)=kclA：吸光度T：透光率，T=It/I0l：液层厚度(光程长度)c：溶液的浓度k：吸光系数朗伯(Lambert)定律：A=K1L比耳(Beer)定律：A=K2c

单色光适用范围：可见光、紫外光和红外光；均匀无散射的溶液、固体和气体。

I0=It+IaA＝-lgT=klc吸收光谱法的基本定律，是定量测定的依据A与c为简单的正比关系；T与c是指数关系A具加合性设共存物为a、b、c，则：A=kalca+kblcb+kclcc1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）入射光为单色光溶液是稀溶液

1、物理意义：指吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度

2、不同物质对同一波长的单色光，有不同的吸光系数，k↑，物质对光的吸收能力↑。吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，是定性和定量的依据。

3、表示方法：k值及单位与c和l采用的单位有关

εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，它的大小反映了光度法测定某物质可能达到的灵敏度。

ε>104

灵敏度高104>ε>103

灵敏度中等ε<103

灵敏度低二、吸光系数2、比吸光系数（百分吸光系数）

在某一波长下，溶液浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时的吸光度。单位：L/(mol·cm)在某一波长下,溶液浓度为1（g/100ml)、液层厚度为1cm时的吸光度。单位：mL/(g·cm)1、摩尔吸光系数ε吸光系数的大小，取决于物质（溶质、溶剂）本性、温度和光的波长。1）物质不同，吸光系数不同，是物质的特征常数；2）溶剂不同，同一物质吸光系数不同，故常在描述吸光系数时需指明某溶剂；3）光的波长不同，吸光系数不同。某化合物的浓度为4.2×10-3g/L，用2.0cm的吸收池在470nm下测得的透光率为30.0%，该化合物的分子量为250，求其在470nm处的摩尔吸光系数和百分吸光系数。例：解：∵A=-lgT=-lg0.300=0.523c=4.2×10-3g/L=4.2×10-4g/100mll=2.0cm课堂互动某有色溶液的物质的量浓度浓度为c，在一定条件下用1cm比色杯测得吸光度为A，则摩尔吸光系数应为：A．cAB．cMC．A/CD．C/A第二节紫外-可见分光光度法的基本原理五、偏离Lambert-Beer定律的因素（一）化学因素吸光物质溶液的浓度稀溶液吸光性物质的化学变化溶剂的影响A＝εlc（二）光学因素(1)非单色光l对策：选择比较好的单色器入射波长选定在待测物质的最大吸收波长处严格地讲，吸收定律只适用于单色光。单色光指具有单一波长的光，但实际上不能得到纯粹的单色光，而是波长范围较窄的复合光。对于同一物质对不同波长的光的吸收程度不同，所以导致对光的吸收定律的偏离。(2)杂散光：单色光中混有一些不在谱带宽度范围内、与所需的波长不符的光，称为杂散光(3)散射和反射光(4)非平行光吸收质点的散射（胶体、乳浊液或悬浊液）吸收池内外界面的反射测得的吸光度偏高l用参比溶液(空白溶液)对比补偿对策：第二节紫外-可见分光光度法的基本原理点滴积累1．光的吸收定律表明了吸光度与液层厚度和浓度之间的关系，它是吸收光谱法定量分析的依据。2．吸光系数的表示方法有多种，随待测溶液浓度的不同标度而不同。3．偏离光的吸收定律的因素主要有化学因素和光学因素。第三节紫外-可见分光光度计一、紫外-可见分光光度计的主要部件：光源—单色器—吸收池—检测器—讯号处理与显示器

一、主要部件：1、光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够强度且稳定（不随λ而改变）

分光光度计中常用的光源有：热辐射光源：钨灯，卤钨灯（可见、近红外光区）

可发射340-2500nm的连续光谱气体放电光源：氢灯，氘灯（紫外光区）发射150-400nm连续光谱氙灯氢灯钨灯2、单色器：是从连续光谱中获得所需波段的单色光的装置。（1）入射狭缝:限制杂散光进入（2）准直镜（透镜或凹面反射镜），它使入射光束变为平行光束。（3）色散元件：棱镜或光栅，它使不同波长的入射光色散开来。（4）聚焦透镜或聚焦凹面反射镜聚焦，它使不同波长的光聚焦在焦面的不同位置。（5）出射狭缝作用：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。但狭缝↓，光强度↓，灵敏度↓3、吸收池（比色皿或比色杯）：用于盛放溶液并提供一定吸光厚度的器皿。它由透明的光学玻璃或石英材料组成。玻璃吸收池只能用于可见光区，而石英吸收池在紫外和可见光区都可使用。光径一般在0.1-10cm，最常用的吸收池吸光厚度为1cm。高浓度常选光径较小的，低浓度选光径较大的。（四）检测器：利用光电效应，将光强度转换成电流讯号。（光信号→电信号）

光检测器：光电池、光电管、光电倍增管和光二极管阵列检测器。（五）信号显示系统：将信号以适当方式显示或记录。

常用的显示器有直读检流计、微安表、电位计、数字电压表、记录仪、示波器及数据处理机等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，既可对分光光度计进行操作控制，又可进行数据处理。二、分光光度计的类型：（一）单波长单光束分光光度计：0.575光源单色器吸收池检测器显示只有一条光路，通过变换参比池和样品池的位置，使它们分别置于光路来进行测定国产751型、752型、721型、722型、UV-1100型、英国SP-500型，伯克曼DU-8型这类分光光度计的特点是：一般用钨灯或氢灯作光源，结构简单，价格便宜。主要适用于定量分析，而不适用于作定性分析。另外，结果受电源的波动影响较大。（二）单波长双光束分光光度计光源比值单色器吸收池检测器显示光束分裂器双光束分光光度计是自动比较了透过参比溶液和样品溶液的光的强度，它不受光源（电源）变化的影响。双光束分光光度计还能进行波长扫描，并自动记录下各波长下的吸光度，很快就可得到试液的吸收光谱。所以能用于定性分析。国产710型、730型、

740型、日立UV-340型、U-4100等属于这种类型。光源单色器Ⅰ单色器Ⅱ检测器切光器狭缝吸收池3、双波长分光光度计：用两种不同波长的单色光束交替照射到样品溶液上，不需使用参比溶液，测得的是样品在两种波长下的吸光度之差。一个光源，两个单色器，一个吸收池211、波长范围2、波长准确度3、波长重现性4、狭缝或谱带宽5、分辨率6、杂散光7、透光率测量范围8、吸光度测量范围9、测光准确度10、测光重现性三、分光光度计的光学性能第三节紫外-可见分光光度计点滴积累紫外-可见分光光度计的基本结构相同，都由光源、单色器、吸收池、检测器、讯号处理与显示器等主要部件构成，但不同型号仪器的外形差别很大，质量和价格相差悬殊，操作方法迥异，使用之前应仔细阅读仪器使用说明书。

00.41.22.02.83.6246%A暗噪声讯号噪声误差曲线从图中可以看出：A值控制在0.2-0.7之间(或T值在20%-65%之间）相对误差较小。方法：改变待测液的浓度选用适当厚度的吸收池1.吸光度范围的选择第四节分析条件的选择（一）、仪器测量条件的选择一般应该选择λmax为入射光波长。如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。2.选择适当的入射波长二、显色反应条件的选择显色反应：在光度分析中将试样中的待测组分转变成有色化合物的反应。显色反应需满足的条件：1．选择性要好，与样品可发生定量反应。2．灵敏度要高：3．有色化合物的组成要恒定，化学性质稳定在紫外-可见光区有吸收，且max较大。

4．显色剂的颜色与有色化合物的颜色差别要大5．反应的条件要易于控制。显色反应条件的控制(1)显色剂用量生成配位化合物的显色反应可用下式表示：M+nR→MRn若配合物稳定性好，显色剂只需稍过量。若配合物不稳定，显色剂需过量很多。若可形成逐级配合物时，显色剂用量应严格控制在一定范围。例：MoMo(SCN)5Mo(SCN)6-桔红色浅红色2、溶液的酸度pH值对显色反应的影响pH值不同，可形成具不同配位数、不同颜色的配合物pH值增大，引起某些金属离子水解，甚至析出沉淀。Fe(SCN)2++OH-→Fe(OH)2++SCN-例：Fe3+与水杨酸在不同pH值生成不同配合物pH值<44-78-10配合物组成Fe(C7H4O3)+Fe(C7H4O3)2-Fe(C7H4O3)33-颜色紫红棕橙黄pH值的确定做A-pH关系曲线，得到合适的pH值范围（3）其他条件显色温度显色时间放置时间溶剂显色反应的速度有快有慢，快的几乎是瞬间完成，颜色很快达到稳定状态，并且能保持较长时间。大多数显色反应的速度是比较慢的，需要一定时间才能达到稳定。而且有些有色化合物放置过久也会褪色。适宜的显色时间、温度要由实验来确定。三、参比溶液选择为什么需要使用参比溶液？所测得的吸光度要真正反映待测溶液的吸光强度。1、溶剂参比试样组成简单、共存组份少(基体干扰少)、显色剂不吸收时，直接采用溶剂(多为蒸馏水)为参比。即试剂、干扰、显色剂均无吸收，用溶剂作参比。注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰。试剂参比：当显色剂和其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂+显色剂作参比(不加待测物)。试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，可以试样作参比(不能加显色剂)。平行操作参比溶液：用不含待测组分的试样，在完全相同条件下与待测试样同时进行处理，得到平行操作参比溶液。第四节分析条件的选择点滴积累1．选择吸光性物质的最大吸收波长作为测定波长。2．使用紫外-可见分光光度计时，读数范围应控制在吸光度为0.2～0.7，透光率为65%～

20%之间。3．待测物质在紫外-可见光区无吸收时，应加显色剂。显色剂不得有干扰，反应必须完全。4．一般用溶剂作参比溶液。必要时采用试样参比溶液、试剂参比溶液或平行操作参比溶液。

第五节定性与定量分析一、定性分析依据：相同的化合物有相同的光谱方法：比较吸收光谱的一致性比较吸收光谱的特征数据比较吸光度的比值定性鉴别纯度检查和杂质限量测定（一）定性鉴别定性鉴别的依据→吸收光谱的特征(λmax和εmax）吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数缺陷：不能鉴定饱和物质及结构相似的化合物。1．对比吸收光谱的特征数据（吸光度或吸光系数）2．对比吸光度或吸光系数的比值：如果化合物有几个吸收峰，可用在不同吸收峰（或峰与谷）处测得吸光度的比值作为鉴别的依据。例：3．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较（二）纯度检查和杂质限量测定1．纯度检查（杂质检查）1）峰位不重叠：找λ→使主成分无吸收，杂质有吸收→直接考察杂质含量2）峰位重叠：主成分强吸收，杂质无吸收/弱吸收→与纯品比较，E↓杂质强吸收>>主成分吸收→与纯品比较，E↑，光谱变形杂质的存在吸收曲线形状改变吸光系数值的大小例：乙醇中含少量的杂质苯乙醇的UV吸收光谱在256nm处没有吸收峰而苯在256nm处有的吸收峰苯的检出限量低达10ppm2、杂质的限量检查测定特定波长的吸光度值，计算杂质的含量在此波长处，杂质有吸收，而药物无吸收测定两个特定波长的吸光度的比值二、定量分析（一）单组分的定量方法1．标准曲线法2．标准对比法：外标一点法3．吸光系数法1、标准曲线法配制一系列不同浓度的标准溶液，分别测定吸光度。绘制A-c标准曲线或计算回归方程。测定样品的A值，从标准曲线上或代入回归方程得到样品的浓度。芦丁含量测定0.710mg/25mL标准溶液一般为5～7个点，至少不少于4个。待测样品和标准溶液应平行处理。标准溶液浓度范围应在溶液吸光度与其浓度呈线性关系区间内，且溶液的吸光度值控制在0.1～1.0之间。用坐标纸绘制完后应注明测定内容，如测定波长、吸收池厚度、操作时间等；长时间不用后再次使用时，以及仪器维修调整后应检查标准曲线，必要时应重新绘制。

注意事项：2、标准对照法：在相同条件下，配制样品和标准溶液。（两种溶液的浓度最好相近）在选定波长处，测定两者的吸光度。根据推导出来的下式计算样品浓度。A标=

c标lA样=

c样l两式的和l值相同外标一点法注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时max

min

A

2.对于同一待测溶液，浓度↑，吸光度↑；3.对于同一物质，不论浓度大小如何，最大吸收峰所对应的波长(最大吸收波长λmax)不变，并且曲线的形状也完全相同。从分析吸收曲线可以知道：1.同一浓度的待测溶液对不同波长的光有不同的吸光度;3、吸光系数法利用从手册或文献查到的或值，根据下式定量：或特点：对仪器要求较高。例9-5:维生素B12的水溶液在处的百分吸光系数值是207，盛于1cm吸收池中，测得的溶液吸光度为0.414，则溶液的浓度为多少？

解:例9-6：维生素B12样品20mg用水溶液配成1000ml。盛于1cm吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.407，求B12的百分含量？（二）多组分的测定方法：在含有多种组分的溶液中，如果要测定多个组分，可以根据情况的不同，采用不同的方法来进行测定。

如果溶液中各组分之间的吸收曲线互相不干扰，可以选择适当的不同的波长分别测定。如图（a)：X,Y组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。如果多个组分之间的吸收曲线有干扰则可利用吸光度的加和性，以解联立方程式的方法，求得各个组分的含量或浓度。图b在混合组分测定中，实际遇到的情况是吸收光谱双向重叠，互相干扰，两组份在最大吸收波长处互相吸收，如图9-7c所示。这时可根据测定的目的要求和光谱重叠情况，采取以下方法.1、解线性方程法：2、等吸收双波长消去法

该方法是在吸收光谱互相重叠的a、b两组份的混合物中，先设法消去组分a的干扰而测定组分b的浓度。即选取对干扰组分a等吸收的两个波长处广度相等（A1a=A2a),而欲测组分b在两波长处的吸光度则有很大的差别，这样，混合组分在两波长处之差△A与待测组分b的浓度有如下关系：测量原理：当试样中组份的浓度过大时，则A值很大，会产生读数误差。此时若以一浓度略小于试样组份浓度作参比（透光率为100%），则有：（三）示差分光光度法-----

高含量组分的测定第五节定性定量方法课堂互动1．在符合朗伯-比尔定律的条件下，有色物质的浓度、最大吸收波长、吸光度三者的关系是A．增加、增加、增加B．增加、减小、不变C．减小、增加、减小D．减小、不变、减小2．维生素D2的摩尔吸收系数264nm=18200。用2.0cm吸收池测定，如果要控制吸光度A在0.699～0.187范围内，应使维生素D2溶液的浓度在什么范围内？第五节定性定量方法点滴积累（1）紫外-可见分光光度法的各种定量方法的优缺点：1．标准曲线法的优点：测定大批量样品时，操作简单、准确、快速。缺点：不同人处理相同的测量数据，得到的结果不易完全相同。2．标准对比法的优点：测量数据相同，任何人都能得到完全一致的结果。缺点：随机误差较大。3．吸光系数法的优点：与标准对比法的优点相同。缺点：测定条件不易与文献完全一致，从而引入误差。

第五节定性定量方法点滴积累（2）紫外-可见分光光度法的各种定量方法的优缺点：4．解联立方程组法的优点：可以不经分离直接测定二元组分溶液。缺点：在两个测定波长处，要求两个组分的吸光系数有较大的差别。5．等吸收波长消去法的优点：可以不经分离直接测定二元组分溶液，还适于测定混浊液的测定。缺点：要求干扰组分的吸收光谱中有一个峰或谷。6．差示分光光度法的优点：可以直接测定高浓度溶液。缺点：需要用高精密度的仪器。

一、选择题（一）单项选择题1．紫外-可见光的波长范围是：A.200~400nmB．400~760nmC．200~760nmD．360~800nm2．下列叙述错误的是：A．光的能量与其波长成反比B．有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈C．物质对光的吸收有选择性D．光的能量与其频率成反比

【目标检测】第六节紫外-可见吸收光谱在有机化合物结构分析中的应用简介3．紫外-可见分光光度法属于：A．原子发射光谱B．原子吸收光谱C．分子发射光谱D．分子吸收光谱4．分子吸收紫外-可见光后，可发生哪种类型的分子能级跃迁：A．转动能级跃迁B．振动能级跃迁C．电子能级跃迁D．以上都能发生第六节紫外-可见吸收光谱在有机化合物结构分析中的应用简介5．某有色溶液的摩尔浓度为c，在一定条件下用1cm比色杯测得吸光度为A，则摩尔吸光系数为：A．cAB．cMC．D．6．某吸光物质的摩尔质量为M，其摩尔吸收系数与比吸收系数的换算关系是A．＝·MB．＝/M

C．＝·M/10D．＝/M×10第六节紫外-可见吸收光谱在有机化合物结构分析中的应用简介7．关于光的性质，描述正确的是：A．光具有波粒二象性B．光具有发散性C．光具有颜色D．本质是单色光8．某吸光物质的吸光系数很大，则表明：A．该物质溶液的浓度很大B．测定该物质的灵敏度高C．入射光的波长很大D．该物质的分子量很大第六节紫外-可见吸收光谱在有机化合物结构分析中的应用简介9．相同条件下，测定甲、乙两份同一有色物质溶液的吸光度。若甲溶液1cm吸收池，乙溶液2cm吸收池进行测定，结果吸光度相同，甲、乙两溶液浓度的关系：A．c甲＝c乙B．c乙＝4c甲C．c甲＝2c乙D．c乙＝2c甲10．在符合光的吸收定律条件下，有色物质的浓度、最大吸收波长、吸光度三者的关系是：A．增加、增加、增加B．增加、减小、不变C．减小、增加、减小D．减小、不变、减小

第六节紫外-可见吸收光谱在有机化合物结构分析中的应用简介11．吸收曲线是在一定条件下以入射光波长为横坐标、吸光度为纵坐标所描绘的曲线，又称为：A．工作曲线B．A-λ曲线C．A-c曲线D．滴定曲线12．标准曲线是在一定条件下以吸光度为横坐标、浓度为纵坐标所描绘的曲线，也可称为：A．A-λ曲线B．A-c曲线C．滴定曲线D．E-V曲线

第六节紫外-可见吸收光谱在有机化合物结构分析中的应用简介13．紫外-可见分光光度计的基本结构可分为：A．二个部分B．三个部分C．四个部分D．五个部分14．722型分光光度计的比色皿的材料为：A．石英B．卤族元素C．硬质塑料D．光学玻璃

第六节紫外-可见吸收光谱在有机化合物结构分析中的应用简介15．紫外-可见分光光度法定量分析的理论依据是：A．吸收曲线B．吸光系数C．光的吸收定律D．能斯特方程16．下列说法正确的是：A．吸收曲线与物质的性质无关B．吸收曲线