第二章紫外-可见分光光度法

第2章紫外-可见分光光度法吸光光度法基本原理光度计及其基本部件显色反应及显色条件的选择吸光度测量条件的选择3.1

概述吸光光度法——基于物质对光的选择性吸收的分析方法比色法比较有色溶液对溶液透过光的强度可见分光光度法紫外分光光度法CuSO4溶液KMnO4溶液为什么这些溶液呈现不同的颜色？Fe3＋＋SCN－→[Fe(SCN)]2＋比较有色溶液对某一波长光的吸收物质颜色与吸收光颜色的互补关系/nm吸收光颜色400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿

当λ＝200－400nm:（近）紫外区，紫外分（吸）光光度法

λ＝400－750nm:

可见光区，可见分（吸）光光度法电磁辐射波动性周期T频率波长波数传播速度c=·光的波粒二象性不同波长的光具有不同的能量波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高粒子性E=h·=hc/3.2

分子光谱概述在分子内部除了电子运动外，还存在核间的相对运动，即核的振动和分子绕着重心的转动。多数分子相应波长对应光区E电1~20eV60~1250nm紫外或可见光区内E振0.05~1eV25~1.25㎛红外E转小于0.05eV1.25cm~25㎛远红外E电＞E振＞E转红外光-分子振动和转动能级跃迁；可应用于分子结构的研究物质对不同波长的光具有不同的吸收能力，物质也只能选择性地吸收那些能量相当于该分子内部三种能量总合E的辐射光由于每种物质分子内部结构不同，能级千差万别，决定了它们对不同波长光线的选择性吸收物质对光的选择性吸收分子的总能量E=E电+E振+E转吸光度和透光度吸收光

反射光

透射光

I0=Ia

+It+Ir入射光

透光度T

——光透过的程度入射光I0透射光It

吸光度

A——物质分子对光的吸收程度T取值为0.0%~100.0%光全部吸收时光全部透射时3.3Lamber-Beer定律ItbLamber定律A∝bA∝cBeer定律Lamber-Beer定律：当一束平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度以及液层厚度的乘积成正比。

A=kbc根据量子化理论:Lamber-Beer定律的推导E=h吸收过程就是光子被吸光质点(分子或离子)所俘获，结果使吸光质点能量增加而处于激发状态；俘获光子的几率与其面积有关如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。当光强度为Ix的单色光通过吸收层(db)后，光强度减弱了dIx，则厚度为db的吸收层对光的吸收率为-dIx/Ix由于db为无限小，所以截面积上所有吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率，即：

-dIx/Ix=ds/s如果进一步在吸收介质里含有m种吸光质点，且它们之间没有相互作用，设ai为第i种吸光质点对特定光子的吸收面积，dni为ds中第i种吸光质点的数目，则：

代入上式，得到:

当光束通过厚度为b的吸收层时，对上式两边积分，得到：

根据前述的吸光度A=lg(I0/It)定义，可得到:将式子中截面积s用均匀介质的体积V和光程b来表示，

即：s=V/b代入上式，得到

NA为Avogadro常数；ni/(NA∙V)即为第i种质点在均匀介质中的浓度(ci)；将0.4343NAai合并为常数k，则：总吸光度等于吸收介质内各种吸光物质的吸光度之和，即吸光度具有加和性。这是进行多组分光度分析的理论基础。A=kbc如果吸收介质内只有一种吸光物质时，公式可简化为:比例常数的表示形式A=abcA：吸光度，描述溶液对光的吸收程度，无单位b：液层厚度(光程长度)，单位cmc：溶液的质量浓度，单位g·L-1k：质量吸收系数，单位L·g-1·cm-1

A=kbcA：吸光度，无单位b：液层厚度，单位cmc：溶液的摩尔浓度，单位mol·L-1ε：摩尔吸收系数，单位L·mol-1·cm-1

A=εbc当浓度为1moL·L-1，厚度为1cm时的溶液，在一定波长下测得的吸光度大小。摩尔吸收系数ε物理意义

ε与物质的性质、入射光波长、温度有关

ε越大，方法的灵敏度越高钢样0.500g溶解后在容量瓶中配成100mL溶液。分取20.00mL该溶液于50mL容量瓶中，其中的Mn2+氧化成MnO4-后，稀释定容。然后在λ=525nm处，用b=2cm的比色皿测得A=0.60。已知ε525=2.3×103L·mol-1·cm-1，计算钢样中Mn的质量分数(﹪)。Lamber-Beer定律的相关计算解：

试样中锰的质量m=1.3×10-4×0.05×5×54.94=17.85×10-4g3.4光谱曲线表示方法波长吸光度吸收曲线标准曲线最大吸收波长max定性分析定量分析AA吸收曲线描述了物质对不同波长光的吸收能力大小，反映了物质分子能级的变化。吸收曲线形状和max的位置以及吸收强度等与分子的结构密切相关。因此，利用吸收曲线可以对物质进行定性分析；而在某一波长下测得的吸光度与物质浓度的工作曲线可对物质进行定量分析。不同物质其吸收曲线的形状和λmax各不相同。不同浓度的同一物质，

λmax不变，在吸收峰及附近处的吸光度随浓度增加而增大。吸收曲线讨论3.5

吸光度的测量吸光度A的测量不同浓度标准溶液的配置工作曲线(标准曲线)A=εbc光吸收定律发生偏离关于曲线不过原点的原因溶液中除了吸光物质吸收入射光以外，含有的其它试剂或离子也可能吸收入射光；另外，在测定过程中，部分光被器皿表面反射而会造成损失。克服方法通常将试液和空白液分别置于相同材料和厚度的比色皿中，此空白液即称为参比溶液。调节仪器，使参比溶液的A=0，然后再测定其它溶液的A值。物理性因素——仪器的非理想性光吸收定律发生偏离的原因1非单色光引起的偏离

L-B定律适用于单色光，而分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。由于物质对不同波长光的吸收程度不同，结果导致曲线负偏离。A实=lg(I0+I0)/(It+It)

=lg(It·10bc+It·10bc)/(It+It)=lg10bc[It+It·10(-)bc]/(It+It)=bc+lg[It+It·10(-)bc]/(It+It)

=A理+A

由于，所以A为负值；A实A理，产生负偏。与的差值及浓度c愈大，则负值A愈大,对光吸收定律的偏离程度就愈严重。推导：

设一束入射光为含有两个波长max、的复合光，两个波长对应的入射光强度分别为I0和I0，透过光强度为It和It，总入射光强度I0总=I0+I0；总透过光强度It总=It+It；选择吸收曲线的max作入射光波长。

因为吸收曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。降低由于单色光不纯造成负偏的方法•选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可能窄。

只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波长。光吸收定律发生偏离的原因2杂散光的影响

不包括在入射光带内即不通过吸收池而直接进入检测器的非单色光。来源：a.仪器内光学部件及机械零件反射和散射的光；b.外界及光源漏进检测器的光；c.光学系统有缺陷而引起的不均匀散射等；杂散光一般引起负偏离。光吸收定律发生偏离的原因3溶液本身的原因溶液浓度的变化显著改变溶液的折射率折射率n校正公式：A=bc·n/(n2+2)2一般在浓度小于0.01moL/L时，n基本上为常数，其影响可忽略不计，说明L-B定律适用于稀溶液。溶液若为胶体溶液、乳浊液或悬浊液时，在入射光通过溶液时，除一部分被吸光粒子吸收外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，A实。所以往往发生正偏离。光吸收定律发生偏离的原因3化学性因素

吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏离。例：P43

习题2,3,5作业3.6

分光光度法原理比较有色溶液(吸光物质)对某一波长的吸收情况特点采用棱镜或光栅等分光元件获得单色光仪器所用仪器称为分光光度计，测量范围不再局限于可见光区域内，可扩展至紫外和红外光区域。分光光度计单光束分光光度计结构图分光光度计主要部件及作用光源可见区光源常用钨灯或碘钨灯，发射波长约为320~2500nm紫外光源多为气体放电光源，如氢、氘放电灯及汞灯等一般仪器上都设置有稳压电源，因为电源电压的变化会引起光源发光强度的波动，从而影响测定结果。钨灯氘灯将光源发出的连续光谱色散为单色光的装置称为单色器单色器利用光的色散原理制成单色器由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜组成单色器工作原理1可见分光光度计—玻璃石英—紫外分光光度计棱镜单色器单色器工作原理2光栅单色器狭缝和透镜调节光的强度，控制光的方向并获得所需波长的单色光当复合光照射到光栅上时，根据光的衍射和干涉原理，色散为不同波长的单色光。吸收池玻璃—可见及红外光区石英—紫外及红外光区盛装试液，决定液层厚度检测器紫外-可见光信号电信号光电效应硒光电池硒光电池当照射光强度不大，且光电池外电路电阻小于100Ω时，光电流i=KI。可直接测量受强光照射或长时间连续使用，会产生疲劳现象，即光电流逐渐下降，i与I不成正比。内阻小，与一般直流放大器不相匹配；温度系数较大，使用时要注意隔热，防止光线直射。易受潮，受潮后光电流大小会不正常，甚至引起光电池完全失效。光电管光电管该电流的大小与照射到阴极上的光强度成正比光电管产生的光电流很小，需经放大后才能被测定。根据阴极光敏材料不同，光谱灵敏区可分为蓝敏和红敏两种。前者在阴极表面沉积Sb-Cs，可用于波长210-625nm测定，后者在阴极表面沉积Ag-Cs2O-Cs，可用于波长625-1000nm测定。显示系统其作用是将检测器输出的电信号以光吸收的形状(A或T)显示。常用的显示测量仪器有电位计、检流计、自动记录仪及数字显示装置。3.7

显色反应与显色剂显色反应：与待测离子反应生成对某波长有较大吸收的物质后再进行测定的反应。

显色剂：加入的试剂

显色反应：

M

+

R

→

MR

（待测组分）（显色剂）（有吸收的物质）

功能化AuNPs与10种重金属离子反应后的比色照片分光光度法对显色反应的要求生成物应组成恒定，稳定性好，显色条件易于控制，保证测量结果有良好的重现性；对照性好，显色剂与有色配合物两者的max差别要在60nm以上。生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即吸收系数(一般指)较大；显色反应的影响因素1显色剂用量cR，AcR，AcR达到某一数值时

A值趋于平坦平坦部分较窄控制cR的量cR，A没有较明显的平坦用某个标准溶液作对比通过实验确定溶液酸度溶液pH会影响显色剂的平衡浓度和颜色影响待测金属离子的存在状态影响生成的配合物的组成pH值范围配合物组成颜色＜4Fe(C7H4O3)+

紫红色(1:1)4-7Fe(C7H4O3)2-

棕橙色(1:2)8-10Fe(C7H4O3)3-黄色(1:3)显色反应的影响因素2显色反应的影响因素3时间、温度条件实验确定干扰离子本身有颜色或与显色剂生成有色配合物，A，正干扰；生成无色配合物，降低被测组分或显色剂的浓度，A，负干扰。消除干扰离子控制溶液酸度加入掩蔽剂利用O-R反应，改变干扰离子的价态利用参比溶液消除显色剂和某些干扰离子选取适当波长采用某种分离方法显色剂无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵等。有机显色剂：种类繁多，如偶氮类显色剂、三苯甲烷类。生色团和助色团生色团吸收紫外-可见光的基团结构：具有不饱和键和未成对电子的基团例：C＝C；C＝O；C＝N；-N＝N-

助色团本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团。结构：含孤对电子，与生色团的不饱和键相互作用例：-OH；-OR；-NH-；-NR2-；-X红移：在分子中引入的一些基团或受到其它外界因素影响，吸收峰向长波方向移动。红移和蓝移蓝移：吸收峰向短波方向移动。三元配合物三元混配配合物适用于配位数较高，容易形成未饱和配合物的金属离子离子缔合物

与混配物不同的是金属离子的配位数已经满足，但电荷没有饱和。一般离子缔合物具有疏水性，主要应用于萃取分光光度测定。金属离子-配合剂-表面活性剂体系如加入某些长链的季胺盐、乳化剂等表面活性剂，可形成胶束化合物，吸收峰有明显的波长红移现象，显著提高灵敏度。3.8

吸光光度法测量条件选择光度测量误差

∵A=-lgTT=100%，A=0T=10%，A=1.0T=0%，A=∞吸光光度读数误差A，读数波动引起的误差，因此选择合适的吸光度范围，可减小测量结果的误差。是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？根据朗伯—比耳定律：A=-lgT=εbc吸光光度读数范围选择要使测定结果(c/c)的相对误差最小，对上式求导应有一极小值。即：得：A=-lgT=0.4343

或T=36.8%当透光度为15%~70%(吸光度0.2~0.8)时，浓度测量的相对偏差较小；此即分光光度分析中比较适宜的吸光度测量范围。测量条件选择入射光波长选择——最大吸收原则有共存组分干扰时，入射波长的选择原则是：

吸收最大；干扰最小无干扰，选择max有干扰，B为干扰物，选择1

例：用丁二酮肟显色测定钢中的镍，其最大吸收波长在470nm左右；试样中的铁用酒石酸钾掩蔽,在同样波长下，也有吸收，对测定有干扰。

从图可知，当波长大于500nm时，干扰变小，所以测定时，可将入射光波长选在500nm以上。虽然灵敏度有所降低，但可消除干扰。丁二酮肟镍酒石酸铁测量条件选择控制适当的吸光度范围A=bc(0.2-0.8)调节b值改变浓度c选择适当的参比溶液I0It参比样品仪器调零A参比=0A总=A参比+εbc=εbc参比溶液的选择参比溶液——测量时用作比较的、不含待测物质但其基体尽可能与试样溶液相似的溶液ABCDA:待测物质B:显色剂及其他试剂C:样品基体D:溶剂测定波长处：B、C、D无吸收，纯溶剂D作参比液B略有吸收，C、D无吸收，“试剂空白”(B、D)作参比液C有吸收，B、D无吸收，“试样空白”(C、D)作参比液B、C有吸收，则应在样品溶液中加入适当的试剂，将被测物掩蔽起来，使之与显色剂不再反应，B、C、D作参比液3.9

定量分析单组分的测定依据：A=εbc标准曲线法标准对比法(试样溶液)(标准溶液)多组分测定多组分同时存在的测定依据：吸收曲线不重叠吸收曲线重叠普通分光光度法的不足问题A过大过小c过高过低读数波动引起误差变大原因空白和待测液A值相差大，A或T的读数落在标尺的一端，造成读数相对误差大。试剂空白作参比，c偏高，T偏小，灵敏度差。差示分光光度法采用一个比待测溶液浓度稍低的标准溶液作为参比溶液cS标准溶液为参比，调节透光度为100%(A=0)，测量待测液吸光度，得到溶液(cX和cS)吸光度的差值。参比样品仪器调零A参比=0A总=

Ax-As=εb(cx-cs)两溶液透光度比值并未改变差示法中相当于把刻度读数放大了10倍双波长分光光度法显色剂与待测物的吸收光谱重叠多组分试样(性质相近与待测物的吸收光谱重叠)浑浊试样背景吸收大的试样(存在散射和特征吸收)双波长分光光度法原理I0I0I1I2A=A2-A1=lgI1/I2=(2–1)bc特点：避免因试样和参比两个吸收池之间的差异所引入的误差消除背景吸收及光散射所引起的误差等吸收法吸收曲线部分重叠思考：测量波长和参比波长如何选择A与cx成正比，与cy无关，即消除了组分Y的干扰。3.10

紫外吸收光谱法多数分子相应波长对应光区E电1~20eV60~1250nm紫外或可见光区内E振0.05~1eV25~1.25㎛红外E转小于0.05eV1.25cm~25㎛远红外分子中价电子跃迁产生，决定于价电子分布和结合光谱图简单，峰形宽，定性分析信号少共轭体系的定量分析，灵敏度高，检出限低电子跃迁类型COHnpsHsp

*s*RKE,BnpE分子轨道理论成键分子轨道反键分子轨道非键轨道电子跃迁能量四种跃迁所需能量ΔΕ大小顺序为：n→π＊

<π→π＊

≤

n→σ＊

<σ→σ＊

主要跃迁类型*所需能量高，一般发生在远紫外区饱和烃中的C–C键属于这类跃迁只能被真空紫外分光光度计检测到作为溶剂使用例：甲烷的λmax为125nm,乙烷λmax为135nm主要跃迁类型n*吸收波长为150～250nm含非键电子的饱和烃衍生物易产生此类跃迁含溴、碘、硫和氮的化合物吸收峰>200nm含氟、氯、氧的化合物吸收峰<200nm化合物λmax(nm)H2O167CH3I258CH3NH2215主要跃迁类型π→π*吸收波长远紫外区的近紫外端或近紫外区εmax一般在104L·mol-1·cm-1以上，属于强吸收单一烯烃

乙烯λmax162

nm共轭烯烃

芳香烃化合物λmax(nm)εmax

(L·mol-1·cm-1)苯254200甲苯261300间二甲苯263300苯的紫外吸收光谱主要跃迁类型n→π*一般在由杂原子直接构成π键的基团中，如-C=O及-C=N跃迁能量最小，λmax最长，吸收强度弱，

ε<100π－π*、n－π*跃迁在分析上最有价值有机化合物的紫外吸收光谱饱和烃及其取代衍生物饱和烃类化合物只含键。因此只产生*跃迁吸收波长在150nm真空紫外区，超出一般仪器测量范围常用