生物工程制药之基因工程制药

生物制药工艺（基因工程制药）

基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。

基因工程制药3.1基因工程技术生产药物的优点：1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

基因工程制药3.2基因工程药物生产的基本过程

目的基因的克隆；构建DNA重组体；将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；工程菌的发酵；外源基因表达产物的分离纯化；产品的检验等。基因工程制药3.2.1制备基因工程药物的一般程序：

获得目的基因

组建重组质粒构建基因工程菌培养工程菌产物分离纯化除菌过滤

半成品检定

成品检定

包装

基因工程制药

基因的表达系统有原核生物系统和真核生物生物系统。选择表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达量的多少和分离纯化的难易。基因工程制药

通常将基因工程药物的生产分为上游和下游技术。上游阶段是研究开发必不可少的基础，它主要是分离目的基因，构建工程菌，主要在实验室完成。下游阶段是从工程菌的大规模培养到产品的分离纯化、质量控制，该阶段是将实验室成果产业化、商品化。

下游加工技术主要包括工程菌大规模培养最佳参数的确定、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。基因工程制药3.3目的基因的获得对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因，而对于真核生物不能进行直接分离。

真核细胞中基因总量较大，从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难，另外，真核基因一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA转录后的加工系统，真核基因转录的mRNA也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因。克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学合成法。

基因工程制药3.3.1内含子（introns）

DNA分为编码区和非编码区，编码区又分为外显子和内含子。一般外显子控制遗传和蛋白质的合成，在真核细胞DNA中有部分区域不参与编码蛋白，使用限制性内切酶测量DNA长度，发现真核细胞的mRNA长度明显小于与之对应的DNA长度。在显微镜下，这部分不编码的区域在转录时会弯曲成环状，“Ω”形，让具有功能的片段靠近，这样，在转译为mRNA时，负责合成mRNA的聚合酶就跳过这些内含子。内含子可能具有分隔基因以免造成复制出现混乱的作用。基因工程制药3.3.2逆转录法

逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA，然后进行互补DNA的克隆表达。从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA，再以互补DNA为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶作用下，最终合成编码该蛋白质的双链DNA序列，该序列不含内含子。

基因工程制药、mRNA的纯化细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难，但是mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸（polyA）组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。

基因工程制药、互补DNA第一链的合成

mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在反转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出互补DNA的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件。dDNA：双脱氧核糖核酸dNTP：三磷酸脱氧核苷dATP：三磷酸脱氧腺苷基因工程制药、互补DNA第二条链的合成

先用碱解或核酸酶(RNaseH)酶解的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA。基因工程制药、互补DNA克隆载体有两种质粒和噬菌体，根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。互补DNA插入片段小于10千碱基对，可选用质粒载体，如大于10千碱基对则选用噬菌体作为载体。基因工程制药3.3.3PCR法（链式扩增-聚合酶反应法）

PCR技术与反转录方法的结合，是合成cDNA的较新方法，该方法是mRNA经反转录合成cDNA第一链，不再合成cDNA第二链，而是在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。基因工程制药3.3.4化学合成法较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成法合成，其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。

人工化学合成的限制：1、不能合成太长的基因，50-60个碱基对；2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难；3、费用较高。基因工程制药3.4基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。进行基因表达，我们所关心的是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性，产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。基因工程制药3.4.1宿主细胞的选择宿主细胞应满足以下要求：1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用廉价易得的原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，产物容易提取。基因工程制药3.4.1宿主细胞的选择

宿主可分为两大类：

原核细胞—大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌；

真核细胞—酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。基因工程制药原核细胞

（1）大肠杆菌

生长迅速、对其研究比较深入，所以常用，特点：表达基因工程产物的形式多种多样，有细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数还可以分泌到细胞外表达。

限制：没有信号肽，所以产品多为细胞内产物，提取时需破碎细胞，这样细胞质内其他蛋白质也释放出来，造成提取困难，由于分泌力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性。

基因工程制药原核细胞

（2）枯草芽孢杆菌

分泌能力强可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体，但该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行降解。

（3）链霉菌

主要特点：不致病、使用安全、分泌能力强、可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。

基因工程制药真核细胞

（1）酵母

特点：是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物，基因组小，仅为大肠杆菌的4倍，世代时间短，有单倍体、双倍体两种形式。繁殖迅速、可以廉价地大规模培养，没有毒性。能将表达产物直接分泌到胞外，表达产物能糖基化。

基因工程制药真核细胞

（2）丝状真菌

特点：有很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工，而且糖基化方式与高等真核生物相似。

（3）哺乳动物细胞

特点：产物可分泌到胞外，细胞培养液成分完全可控制，使产物纯化较容易，表达产物能糖基化，接近或类似与天然产物；动物细胞生产慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。

基因工程制药真核细胞

综上所述，目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。因为对它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和DNA导入方式，并且许多外源在这两种宿主菌中得到表达成功。

基因工程制药3.4.2大肠杆菌中的基因表达、载体具备的基本条件根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载体应具备下列条件：（1）载体能够独立复制，有复制起点，有严紧型和松弛型，严紧型伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝少（1-3）；松弛型的复制可不依赖与宿主细胞，在宿主细胞中拷贝多达3000个。（2）应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。（3）应具有很强的启动子，能为达成杆菌的RNA聚合酶所识别。（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。（5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。（6）所产生的mRNA必须有翻译的起始信号。基因工程制药3.4.2大肠杆菌中的基因表达、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素

外源基因在宿主中的表达受许多因素影响的，所以在建立表达体系时要综合考虑各种因素的作用，建立一个合适的表达体系，从而使外源基因得到最大的表达量，获得最多的表达产物。（1）外源基因的拷贝数（剂量）外源基因是克隆到载体上的，所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因的表达相关，应将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对于提高外源基因的总体表达水平非常有利。基因工程制药3.4.2大肠杆菌中的基因表达（2）外源基因的表达效率

A.启动子的强度（在转录水平上直接影响基因的表达）真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，真核基因欲高效表达，必须将真核基因编码区置于大肠杆菌RNA聚合酶能识别的强启动子控制下，常用的强启动子有lac,

trp,

tac,

PL,bla等。

B.核糖体结合位点的有效性

C.SD序列和起始密码的间距，主要指表达非融合蛋白。SD序列（Shine-DelgarnoSquence）：1974年由J.Shine和Delgarno发现故此命名，mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列，在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列能与16srRNA的3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。

D.密码子的组成等都会不同程度地影响外源基因的表达。基因工程制药3.4.2大肠杆菌中的基因表达（3）表达产物的稳定性

表达的外源基因，作为应急反应，宿主细胞迅速产生降解该蛋白质（目的产物）的酶，使得实际产量很低。可采用下列方法来提高表达产物的稳定性：组建融合基因，产生融合蛋白形式；B.利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；C.采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；D.选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。基因工程制药3.4.2大肠杆菌中的基因表达（4）细胞的代谢负荷外源基因在宿主细胞内的大量表达，必然会影响宿主细胞正常的生长代谢，有些产物对宿主还会有毒害作用，将细胞杀死，为了减轻宿主细胞的代谢负荷，同时还得提高外源基因的表达水平，可以采取以下手段或方式：A.当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的表达。即将细胞的生长和外源基因的诱导表达分成两个阶段，使表达产物不会影响细胞的正常生长，当宿主细胞的生物量达到饱和时，再进行基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷；B.将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开，当宿主细胞迅速生长时，抑制重组质粒的复制，当细胞生长量累积到一定水平后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加质粒拷贝数。（缺点：外源基因大量表达的同时，质粒上其他基因也大量表达，不利于产物分离纯化）

基因工程制药3.4.2大肠杆菌中的基因表达（5）工程菌的培养条件

优化培养条件使外源基因大量表达。质粒载体PBV220和PET系统介绍（课本23页）IPTG：异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside）Bindingoftherepressor-

IPTGcomplextotheoperatorcanbestudiedbyusinggreaterconcentrationsoftheproteininthemethylationprotection/enhancementassary.Thelargeamountcompensatesfortheoperator,thecomplexmakesexactlythesamepatternofcontactswithDNAasthefreerepressor.AnanalogousresultsisobtainedwithmutantrepressorswhoseaffinityforoperatorDNAisincreased,theytoomakethesamepatternofcontacts.

基因工程制药3.4.2大肠杆菌中的基因表达IPTG：异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside）

IPTG一般用于蛋白的诱导表达，IPTG与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使乳糖阻遏蛋白的空间构象发生变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成。基因工程制药3.4.3真核基因在大肠杆菌中的表达形式

包含体：外源蛋白在大肠杆菌中表达时，它们的构象发生改变，或由于产生不合适的二硫键，或由于表达的蛋白不能正确折叠，因此不能形成具有活性的蛋白质，而是形成水不溶性物质，即包含体，包含体的形成大大降低了表达产物对宿主的毒害作用。

基因工程制药3.4.3真核基因在大肠杆菌中的表达形式

三种：融合蛋白、非融合蛋白、分泌型。

（1）融合蛋白

融合蛋白即通过基因重组技术得到的两个基因重组后的表达产物，对于大肠杆菌表达的融合蛋白，它的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。

优点：基因操作简便、蛋白质在菌体内比较稳定、不易被细菌酶类所降解、容易实现高效表达。

缺点：只能做抗原用，原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原性。可通过化学处理或特异性酶再切割，除掉融合蛋白的氨基端原核多肽，从而获得生物活性。

基因工程制药3.4.3真核基因在大肠杆菌中的表达形式

（2）非融合蛋白

非融合蛋白：指在大肠杆菌中表达的蛋白以真核蛋白的mRNA的AUG为其始，在其氨基端不含任何原核多肽序列。表达非融合蛋白的操纵子必须改建为：细菌或噬菌体的启动子—细菌的核糖体结合位点（SD序列）—真核基因的起始密码子—结构基因—终止密码。关键点：要求核糖体结合位点序列与翻译起始密码之间的距离要合适，稍有不适就会影响表达效率。

优点：能够较好地保持原来的蛋白活性；

缺点：容易被蛋白酶破坏，氨基末端常带有甲硫氨酸，在人体内用药时可能会引起人体免疫反应。

基因工程制药3.4.3真核基因在大肠杆菌中的表达形式

（3）分泌型

将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时，被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。

特点：一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中是稳定的；由于有些蛋白质能按一定的方式折叠，所以在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性；蛋白质信号肽和编码序列之间能被切割，因而分泌后的蛋白质产物不含起始密码所编码的甲硫氨酸。产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割。

基因工程制药3.5酵母中的基因表达

3.5.1、酵母载体

酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单位。从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段再转入酵母中。

基因工程制药3.5酵母中的基因表达

克隆载体：既能在原核细菌中进行质粒复制和表型选择，又能在酵母中进行质粒复制和表型选择，这类质粒称为克隆载体，这样构成的载体同时带有细菌和酵母的复制原点和选择性标记。表达载体：将酵母的启动子和终止子等有关表达控制序列引入克隆载体的适当位点后，就构成了酵母的表达载体系统。

基因工程制药3.5酵母中的基因表达

酵母表达载体有两类：普通表达载体和精确表达载体。

普通表达载体：只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸是否有增减并无严格要求。

精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。

基因工程制药3.5.2影响目的基因在酵母菌中表达的因素

（1）外源基因的剂量（拷贝数）拷贝数要适当，高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达，但会引起细胞生长量的降低，单拷贝的质粒载体对细胞的最大生长没有影响，能达到较高效的表达

基因工程制药3.5.2影响目的基因在酵母菌中表达的因素

（2）外源基因的表达效率

与启动子、分泌信号、终止序列有关。（P29）酵母的启动子由上游激活序列和近端启动子（包括转录必需序列和起始密码子）组成。要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆到酵母表达载体的启动子和终止子之间，构成表达框架。组成型启动子：在酵母的各个生长时期全部存在并发挥作用，过早表达影响生长从而影响表达总量。诱导型启动子：表达受诱导物或诱导条件的影响，分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。

终止序列保证了转录产物在适当的部位终止和加上多聚腺苷酸尾巴，这样形成的mRNA可能比较稳定并被有效地翻译。

基因工程制药3.5.2影响目的基因在酵母菌中表达的因素

信号肽Signalpeptide：是引导合成肽链转移到内质网（ER）上的一段多肽，位于新合成肽链的N端，一般16-30个氨基酸残基，含有6-15个带正电荷的非极性氨基酸，由于信号肽又是引导肽链进入ER网腔的一段序列，又称开始转移序列（Starttransfersequence）。前导肽leaderpeptide：信号肽的一种，位于成熟蛋白的N端，引导蛋白穿膜，并在后来被剪切掉，又称转运肽，是游离核糖体上合成蛋白质的N端信号，运送蛋白质。基因工程制药3.5.2影响目的基因在酵母菌中表达的因素

（3）外源蛋白的糖基化

外源蛋白在分泌过程中发生糖基化。

糖基化为蛋白质的重要翻译后修饰过程，根据糖链和肽链的连接方式分为N-糖基化和O-糖基化。所谓蛋白质糖基化工程是通过对蛋白质表面糖链进行改造，从而改良蛋白质性质的一种技术，糖基化对蛋白质的理化性质影响主要有：①溶解度，糖基化往往使蛋白质的溶解度提高；②电荷，使蛋白质的负电荷增加，因为糖醛酸、唾液酸解离后一般带负电荷；③增加蛋白质的稳定性；④影响蛋白质的转运；⑤增加糖蛋白的分泌效率。3.5.2影响目的基因在酵母菌中表达的因素

（4）宿主菌株的影响

宿主菌株应具备下列要求：菌体生长力强；非分泌型，表达产量与酵母生长密度正相关菌体内源蛋白酶要较弱；菌体性能稳定；宿主菌株多为突变株，避免使用回复突变率高的不稳定菌株。最好使用二倍体或多倍体。分泌能力强。

基因工程制药3.5.3动物细胞中的基因表达

动物细胞表达的特点：产物可分泌到细胞外，培养液成分可人工调控，产物纯化比较容易，产物是糖基化的，接近或类似于天然产物；但动物细胞生长慢，单位体积生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较小。基因工程制药3.6基因工程菌的稳定性（P32）基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，至少维持25代以上。有分裂不稳定和结构不稳定，分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象；质粒结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

基因工程制药3.6基因工程菌的稳定性（P32）3.6.1质粒不稳定产生的原因常见的是分裂不稳定，与两个因素有关：1）含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关。2）这两种菌的比生长速率差异的大小。含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加工程菌中的质粒拷贝数能提高质粒的稳定性。含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，因而对这类菌进一步提高质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势。基因工程制药3.6基因工程菌的稳定性（P32）3.6.1质粒不稳定产生的原因3）质粒稳定性的分析方法：将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10-12小时，然后随机挑出100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板上，培养10-12小时，统计长出的菌落数，每一样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性

基因工程制药3.6基因工程菌的稳定性（P32）3.6.2提高质粒稳定性的方法

除了选择合适的宿主菌和载体外，采用两阶段法，第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。适当的操作方式也可使工程菌生长速率具有优势，调控温度、pH、培养基组分、溶解氧，通过间歇供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。

基因工程制药3.7基因工程药物的分离纯化3.7.1分离纯化前的准备

主要包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐种类和浓度、溶解度、pH黏度、流体力学性质和热力学性质。含目的产物的初始物料的特点1）菌种类型、形式，产物和副产物种类，产物所处位置，产物类似物、毒素和能降解产物的酶类2）原材料和培养基的来源及质量是否稳定。3）生产工艺和条件。包括灭菌方法、条件和生产方式和过程控制条件等。4）初始物料的物理、化学和生物学特性。

基因工程制药3.7.1分离纯化前的准备物料中杂质种类和浓度

相关性和非相关性杂质的含量、化学性质与结构、相对分子质量、电荷性质和数量、生物学性质、稳定性（对热、盐、pH、有机溶剂等）、杂质溶解度、分配系数、挥发性和吸附性能等。基因工程制药3.7.1分离纯化前的准备目的产物的特性目的产物主要有化学、物理和生物学性质，主要包括化学组成、相对分子量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性（对热、盐、pH、有机溶剂和金属离子等）、疏水性、扩散性、扩散系数、吸附性能、生物活性、亲和性、配基种类和表面活性等。

产品质量要求主要包括质量指标（纯度、含量、生物活性、比活等）、产品用途。允许杂质的种类和相应的含量等。基因工程制药3.7.2分离纯化的基本过程（p47，图2-8）3.7.3细胞破碎方法物理法、化学法和生物法物理法：匀浆法、珠磨法、超声法、高压挤压法等化学法：渗透冲击、增溶法、脂溶法生物法：酶溶法基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化（p50）离子交换层析1）离子交换层析（ionexchangechromatography，IEC），以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。2）正吸附和负吸附：将目的产物离子化，然后交换到介质上，而杂质不被吸附，从离子交换柱上首先流出，称为正吸附，该方法获得的目的产物纯度高，还可以对产物起到一定的浓缩作用，适于处理产物浓度低，工作浓度大的溶液。将杂质离子化后被交换，目的产物不被交换而直接流出，称为负吸附，适于处理产物浓度高的工作液，但去除杂质效果较差，产物纯度不高。

基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化（p50）离子交换层析3）离子交换剂：由三部分组成，分别为载体、活性基团（功能基团）和平衡离子（反离子）组成阳离子交换剂：活性基团带？？？，平衡离子带？？？阴离子交换剂：活性基团带？？？，平衡离子带？？？4）离子交换剂的再生：指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原有性状的过程，一般先用大量水洗，再用酸碱交替浸泡的方式处理，除去与活性基团结合的杂质，使交换剂恢复原有的交换能力。3.7.4重组蛋白的分离纯化（p50）离子交换层析5）离子交换剂的转型：是指离子交换剂由一种活性离子转为另一种活性离子的过程，用HCl可以将阳离子树脂转为Cl型，用NaOH处理可以将其转化为OH型，用甲酸钠处理可以转为甲酸型。6）离子交换剂的保存：首先处理洗去蛋白等杂质，加入适当的防腐剂，一般加入0.02%的叠氮化钠，4℃下保存。基因工程制药基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化（p50）离子交换层析6）离子交换过程树脂选择

主要考虑交换剂结合力的强弱，如疏水性强（疏水性强适合分离小分子物质，如氨基酸、核苷酸）和亲和力强弱（亲和力强适合分离蛋白质），树脂的分辨率，树脂的稳定性，树脂的交换容量，树脂的操作条件等（p53，纤维素、葡聚糖、琼脂糖离子交换载体）。树脂的处理和装柱：去杂、清洗、转型树脂的平衡：平衡缓冲液的离子强度和pH选择要从产物的稳定性，产物与杂质与交换剂的结合力大小和平衡缓冲液本身是否与离子交换剂结合几个方面考虑。基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化（p50）离子交换层析上样

主要考虑的样品浓度，树脂交换容量（对目的产物和杂质），树脂的亲和力。洗脱梯度洗脱：分为离子强度梯度洗脱和pH梯度洗脱，前者即改变洗脱液的离子强度，使与离子交换剂结合的各组分洗脱下来。pH梯度洗脱是改变洗脱液pH值来进行梯度洗脱的一种方法，一般对于阳离子交换剂，洗脱液pH值是从低到高改变。对于阴离子交换剂，洗脱液pH值是从高到低改变。阶段洗脱：采用不同种类的缓冲溶液分阶段进行洗脱，当分离组分与树脂的亲和力差别较大时，采用该方法比较适合。基因工程制药思考题：1.影响离子交换层析分辨率的主要因素有哪些？2.洗脱过程主要的考察因素有哪些？基因工程制药疏水层析1）疏水层析（hydrophobicinteractionchromatography，HIC），是利用不同蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对各种蛋白质进行分离的方法。流动相一般采用中性盐溶液，通过改变盐溶液的浓度使目的蛋白从层析介质上被逐步洗脱下来，蛋白质与固定相之间主要是疏水作用力，因此，蛋白质不易变性和失活。基因工程制药疏水层析2）疏水层析的基本原理蛋白质表面多由亲水基团和部分疏水基团（疏水区域）组成，不同蛋白质疏水区疏水性强弱不同，对于同一种蛋白质由于盐浓度等外环境的不同，其表面疏水力强弱也不同，在离子强度较高的盐溶液中，蛋白质表面疏水部位的水化层容易发生破坏，暴露出较多的疏水部位，即疏水作用力增大，从而使蛋白质在疏水介质上分配系数增大。因此疏水层析一般采用高浓度盐溶液上样，低浓度盐溶液进行洗脱。基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化（p50）疏水层析3）疏水层析的介质多聚糖（如琼脂糖）：机械强度差，少用硅胶（Si-O-Si-C或Si-C键合）常用疏水功能基：苯基、短链烷基、丁基、烷氨基、聚乙二醇、聚醚等。疏水作用与功能基的疏水性和密度成正比，功能基修饰密度过小，疏水力不足，密度过大洗脱困难。基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化疏水层析4）影响疏水层析的主要因素离子强度离子种类：遵循Hofmeister原则疏水作用是一种吸热过程，因此增加温度可以提高蛋白质与功能基的作用力，有利于蛋白吸附，但温度上升容易使蛋白变性失活。

表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，减弱蛋白质的疏水吸附。基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化疏水层析4）疏水层析对蛋白复性的基本原理变性蛋白进入疏水层析柱后，变性蛋白瞬间失去水分子，形成局部疏水环境以利于蛋白分子形成疏水核，并从疏水核开始折叠。随着流动相的不断变化，变性蛋白逐渐得以复性，最后被洗脱下来。并不针对发生不可逆变性的蛋白。基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化

亲和层析（p56）1）亲和层析（affinitychromatography,AC）是利用固定化配体与目的蛋白之间特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既特异又可逆，改变条件可以解除这种结合。2）亲和层析的原理通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质（载体）上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体与载体共价结合，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。蛋白质生物特异性可以帮助选择特异性的配体，一般目的蛋白与配体结合而不保留杂质，要选择亲和力适中而特异性较强的配基，其解离常数要求在10-8~10-4mol/L。基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化

亲和层析（p56）3）亲和吸附剂（载体）①良好的理化稳定性②较多的化学活性基团，能与配体稳定共价结合，并且在结合后不改变基质与配体的基本性质。③多孔立体网状结构，使被吸附的大分子自由通过而增加配体的有效浓度。④高亲水性的惰性物质，减少非特异性吸附，同时使生物分子容易接近。⑤良好的机械性能以及颗粒的均一性。基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化

亲和层析（p56）4）常用亲和吸附剂（载体）①纤维素：无定性微纤维、微晶纤维素和球状纤维素等。②琼脂糖凝胶：由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖相互结合的链状多糖。商品主要有：Sepharose2B,Sepharose4B,Sepharose6B(pharmacia),UtralgelsA-2、A-4、A-6SepharoseCL（2，3-二溴丙烷处理的琼脂糖）③聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺与甲叉双聚丙烯酰胺聚合物）商名品：Biogel-P④其它：UtralgelsACA等。基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化

亲和层析（p56）5）配体理论上，亲和层析的任何一方都可以作为配基，作为配基的理想配体一般满足条件：①与待分离物亲和力适当②与待分离物特异性较强以保证较高分辨率③与载体稳定结合，并在结合后结构无明显变化④较稳定，尽可能重复使用。分为：特异性配体非特异性配体基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化

亲和层析（p56）6）载体的活化基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化

亲和层析（p56）7）配体与载体的偶联基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化

亲和层析（p56）8）操作过程上样：①慢（上样速度要慢；平衡过程慢；可以多次上样）②缓冲液离子强度适当③上样温度较低洗脱：分为特异性洗脱和非特异性洗脱特异性洗脱：可以用与配体有亲和力的洗脱物质进行洗脱；也可以与目的产物有亲和力的洗脱物质进行洗脱。非特异性洗脱：改变外界条件，包括洗脱液pH、离子强度和温度等因素，降低目的产物与配基亲和力而将之洗脱下来，上述条件的选择以不使产物丧失活性为根本原则。基因工程制药3.7.4重组蛋白的分离纯化

亲和层析（p56）9）金属螯合层析（ChealtingAC）一般采用环氧活化型Sepharose6B与金属螯合剂（如EDTA、二亚氨二己酸、氨基水扬酸、8-羟基喹啉等）偶合成配基，再用金属离子处理（如Ni2+、Zn2+、Cd2+等），制成金属螯合层析柱，一些含有His、Cys、Trp、Phe的蛋白质可以用上述层析方法进行分离纯化，也可以用于寡聚核苷酸等分离。基本处理方法：将环氧型琼脂凝胶膨胀洗涤→将亚二氨二醋酸钠溶于4mol/L的Na2