乙型肝炎血清学和分子生物学检测技术

乙型肝炎病毒血清学和分子生物学检测技术

临清市疾病预防控制中心

乙肝病毒研究历史

1963年Blumberg在澳洲土著人血清中发现，简称澳抗。1970年Dane发现HBV病毒颗粒，称Dane颗粒1983年将HBV归为嗜肝病毒科3我国HBV感染概况一般人群HBsAg携带率高达7.18%；现有慢性HBV感染者约9300万人，占全世界的1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过

2000万例，占全世界慢性乙肝患者的1/3；15岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，1-4岁组仅为0.96%。3

病毒形态与基因结构嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)正肝DNA病毒属电镜：3种形态结构和基因HBV的基因组长约3.2kb，非闭合的双股环状DNA。短链：为正链，长度是长链的50％～100％长链：为负链，含HBV全部遗传信息有4个开放读码框架：

S区：编码HBsAg；前S1抗原、前S2抗原

C区：编码HBcAg和HBeAg；

X区：编码HBxAg，并与肝细胞癌变有关

P区：编码DNA多聚酶。其中S区和前S区的基因容易发生变异。HBV基因组和基因表达产物3200bp4openreadingframes7proteins

大蛋白(preS1-preS2-S)

中蛋白(preS2-S)

小蛋白(HBsAg)

核衣壳(HBcAg)HBeAg

聚合酶X蛋白HBV基因型的世界分布基因型分布的国家和地区ABCDEFGH西欧、北欧、北美、中非东南亚、中国、日本东亚、中国、日本、波利尼西亚等南欧、地中海、印度西非美国土著人、波利尼西亚、中南美美国、法国尼加拉瓜、墨西哥、美国血清型adw2ayw1adw2ayw1adw2adrq+adrq-ayrayw2ayw3ayw4adw4q-adw2ayw4adw2?机体感染HBV后产生相应的免疫反应，形成多种不同的抗原抗体系统表面抗原抗体系统(HBsAg，抗-HBs)e抗原抗体系统(HBeAg，抗-HBe)核心抗原抗体系统(HBcAg，抗-HBc)

HBsAg

最早出现的血清学标志之一是HBV感染的基本标志

HBsAg阳性见于乙肝的潜伏期、急性期慢性乙肝病毒携带与HBV感染有关的肝硬化和原发性肝细胞癌抗-HBs

特异性中和抗体、保护性抗体抗-HBs阳性可见于乙型肝炎恢复期，在HBsAg消失后间隔一定时间抗-HBs出现隐性感染的健康人，自身产生了免疫力注射乙肝疫苗或乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)后，产生的主动或被动免疫HBeAg

与HBsAg平行出现，较HBsAg消失早意义体内HBV复制、传染性强的标志急性乙型肝炎的辅助诊断判断预后的指标：HBeAg转阴，表示HBV复制减少或终止，预后好；若HBeAg持续阳性，则预后不良，易转为慢性抗-HBe

HBeAg消失后出现无症状HBV携带者及非活动期慢性肝炎患者表示HBV在体内复制减少或终止，传染性减弱或消失HBcAg

不能从血清中直接检出

Dane颗粒经去垢剂处理HBcAg释放检测抗-HBc

非中和抗体、分IgM和IgG

主要见于慢性感染和既往感染抗-HBc

IgM

通常在出现症状时即可检出，一般持续约6个月，提示HBV复制，是急性感染的重要指标，也是慢性活动性肝炎的重要标志抗-HBc

IgG

在抗-HBc

IgM下降及消失后出现，可伴随感染者终生存在临床机构一般常规检测抗-HBc

，但检测抗-HBc

IgM相对较少（乙肝6项）。抗-HBc

IgM≠抗-HBc，检测试剂盒也不同，需正确区分IgManti-HBcHBsAg0481216202428323652100急性HBV感染的血清学变化暴露后时间滴度HBeAganti-HBeSymptomsanti-HBsTotalanti-HBcHBVDNAWindowPeriodIgManti-HBcTotalanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216202428323652滴度暴露后时间慢性HBV感染的血清学变化HBV感染血清学常见模式临床及流行病学意义HBsAg抗-HBs抗-HBcIgG

IgMHBeAg抗-HBe潜伏期末期+﹣﹣﹣+/﹣﹣急性乙肝，病毒长期携带+﹣+++﹣HBsAg阴性的急性感染﹣﹣﹣+﹣﹣感染消除，抗-HBs尚未出现﹣﹣+﹣﹣﹣健康携带者+﹣++/-﹣+慢性乙肝，病毒长期携带+-++/-+-HBV近期感染，恢复期﹣+++/-﹣+HBV既往感染，已恢复﹣+/-+﹣﹣﹣﹣乙肝疫苗接种﹣+﹣﹣﹣﹣17生物化学检测1HBV血清标志物的检测2HBV分子生物学诊断3

HBV感染的实验室检查乙型肝炎的生物化学检测主要指标：ALT,AST,血清白蛋白，球蛋白血清胆红素，碱性磷酸酶其它18方法学的发展ELISA：灵敏性高，成本低，适用于普通病人筛查；胶体金免疫层析法(金标法)：简便易行，可用于急诊病人快速检测或无偿献血人员粗筛检测HBsAg；化学发光法定量检测：价格昂贵，可用于HBVMs为临界值的病人的确证；在评价抗病毒治疗的病毒学应答、疗效和判断预后方面有重要意义。新增检测指标Pre–S1抗原等192.HBV血清标志物检测HBV基因型和基因变异研究：必要性主要方法HBV-DNA病毒载量测定：PCR结合荧光探针技术病毒复制水平最可靠，最直接的证据，与传染性和疾病进展密切相关；主要用于HBV感染的判断，治疗适应症的选择及抗病毒疗效的判断。HBV耐药突变的检测3.HBV分子生物学检测病毒基因突变疾病进展临床表现对干扰素应答耐药变异生化学改善HBeAg血清学转换HBVDNA清除急性乙型肝炎慢性乙型肝炎肝硬化(LC)肝细胞癌(HCC)21HBV基因型/基因亚型乙肝病毒基因分析技术路线HBVDNA提取PCR扩增相应区段PCR产物直接测序生物信息学分析与数据信息挖掘血清与资料收集22MWIEDFYMS195196I19821015816499121124137138139107149147GD--S-S-S-SS-SS-SLoop1of“a”determinantLoop2of“a”determinant145144ERAlphahelicase

Vaccineescapemutant

Lamivudineresistantmutant

F(苯丙)Y(酪)E(谷)D(天冬)I(异白)M(蛋)W(色)S(丝)M(蛋)I(异白)

D(天冬)E(谷)G(甘)R(精)

2013中央补助地方项目抗-HBc

IgM

实验室检测技术ELISA（最常用，定性）免疫层析法（胶体金或硒标法）发光免疫分析（定量)HBV感染的血清学诊断方法抗-HBc

IgM检测方法：ELISA/发光免疫分析法，本项目采用ELISA方法ELISA检测实验室配备基本仪器酶标仪洗板机移液器干式恒温箱恒温水浴箱或-20℃低温冰箱普通冰箱抗-HBcIgM

酶免检测收样：血清标本收样登记表：抗-HBc

IgM1:1000标本检测登记表.doc（县级需检测）慢性乙型肝炎血标本送检表.doc

（县级不必检测）样品整理、编号样本保存：标本宜新鲜时检测，若5天内检测，可使用冰箱2～8℃保存，超过1周测定，应-20℃保存检测项目：抗-HBc

IgM检测时限：每月10日前完成上月标本检测检测试剂：省统一购置，分次到省疾控免疫所肝炎实验室领取。试剂储存：2～8℃保存，注意效期结果反馈抗-HBc

IgM1:1000标本检测登记表（乙肝监测项目用）.

省（直辖市）

市

县（市、区）试剂生产厂家：血标本编号报告卡编号姓名性别送检日期检测日期检测结果

慢性乙型肝炎血标本送检表（乙肝监测项目用）.

省（直辖市）

市

县（市、区）标本送检人签字：

标本接受人员签字：

血标本编号报告卡编号姓名性别采样日期送检日期乙型肝炎病毒核心IgM抗体诊断试剂盒（ELISA法）操作说明原理:采用捕获法ELISA原理，用抗人μ链捕获待测血清中特异性IgM，洗板侯加入抗原结合酶进行二次温育。当样品中存在核心IgM抗体时，形成”抗μ链-IgM抗体-抗原结合酶“复合物。最后加底物显色。标本要求：血清或血浆，样本量足够；污染、标本量不足、严重溶血标本不宜作此项检测试剂生产厂家：北京万泰生物药业股份有限公司包装规格：48人份/盒试剂盒组成：包被反应板，酶标试剂，阳性对照血清，阴性对照血清，浓缩洗涤液，显色剂A液，显色剂B液，终止液，封口膜，密封袋。试剂储存条件及有效期：2-8°C保存操作步骤1、平衡：将试剂盒取出，平衡至室温30min，微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。标本也需室温平衡30min。

2、配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。3、编号：将微孔条固定于支架，按序编号，设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（双波长可不设空白孔）。4、稀释：将待测标本用生理盐水做1：1000稀释（质控品及阴阳性对照不稀释）5、加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴阳性对照100ul，6、温育：封板、37℃温育30分钟。7、洗涤：5遍，最后1次尽量扣干8、加酶：每孔加酶标试剂100ul，空白孔除外9、温育：同步骤610、洗涤：同步骤711、显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul，混匀，37℃避光显色15min12、测定：每孔加入终止液50ul，混匀，10min内测定结果。设酶标仪波长450nm（建议用双波长450/600-650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。参考范围阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔A值≤0.1（若有1孔阴性对照孔A值大于0.1应舍弃该空，弱两孔或以上阴性对照孔A值都大于0.1，应重复实验。阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔A值≥0.8结果判定临界值（CUTOFF)计算：临界值=阴性对照孔A均值×2.1阳性判定：样品A值≥临界值（CUTOFF)判为阳性阴性判定：样品A值≤临界值（CUTOFF)判为阴性注意事项待测样品要求冷冻样品实验前需溶解并混匀，使用前请将样品室温平衡30分钟以上。如样品有杂质、浑浊现象，检测前应3500转/分离心5分钟，取上清液检测续待测样品1：1000稀释方法-非常关键稀释液为0.9%生理盐水。稀释方法:尽可能连续倍比稀释（1：10，连续3次）不建议直接在1ml生理盐水中加入1μl血清,此种操作容易出现误差。续实验操作严格按照标准操作步骤进行。每次均需设阴性和阳性对照原始记录：完整的实验原始记录，如试剂批号，结果原始OD值，并保存好原始记录。每次实验结束后，将结果及时填写在抗-HBc

IgM1:1000标本检测登记表.doc，注意表中请增加两点，试剂批号和结果原始S/CO值:s为标本OD值，CO为该批标本检测判定的临界值，二者的比值。抗-HBc

IgM1:1000标本检测登记表（乙肝监测项目用）.

省（直辖市）

市

县（市、区）试剂生产厂家：试剂批号：

血标本编号报告卡编号姓名性别送检日期检测日期检测结果S/CO注：1.“报告卡编号”为NNDRS中自动生成的病例编号（18位）；2.“检测结果”在相应位置填写：1=阳性；2=阴性；3=未检测。检测单位：

检测人员：续试剂使用试剂在使用之前室温平衡30分钟。国产试剂为定性试剂，不能作为定量试剂使