标准解读

《GB/T 22333-2008 日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法》是一项国家标准，它详细规定了用于检测日本乙型脑炎病毒（JEV）核酸的反转录聚合酶链反应（RT-PCR）的具体操作流程。该标准适用于从疑似感染日本乙型脑炎的病人样本或动物样本中提取RNA，并通过RT-PCR技术来定性检测是否存在JEV RNA。

根据此标准，整个实验过程包括但不限于以下几个关键步骤：

  • 样品采集与处理：首先需要正确地收集并妥善保存待测样本，如血液、脑脊液或其他体液等。接着对这些生物样本进行适当的预处理，以便后续能够有效地分离出总RNA。
  • RNA提取：采用合适的试剂盒或者方法从上述处理过的样本中纯化出高质量的RNA，这是保证后续扩增反应成功的基础。
  • 反转录合成cDNA：利用特异性的引物以及反转录酶将提取到的目标RNA逆转录成互补DNA(cDNA)。
  • PCR扩增：选择针对JEV保守区域设计的特异性引物，在热循环条件下进行多次循环扩增，以达到指数级增加目标DNA片段数量的目的。
  • 结果分析：最后通过凝胶电泳等手段观察PCR产物，根据是否有预期大小的条带出现来判断原始样本中是否含有JEV RNA。


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  • 废止
  • 已被废除、停止使用，并不再更新
  • 2008-08-22 颁布
  • 2008-12-01 实施
©正版授权
GB/T 22333-2008日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法_第1页
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文档简介

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犅４１

中华人民共和国国家标准

犌犅／犜２２３３３—２００８

日本乙型脑炎病毒

反转录聚合酶链反应试验方法

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２００８０８２２发布２００８１２０１实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

书

犌犅／犜２２３３３—２００８

前言

本标准的附录Ａ为规范性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。

本标准主要起草人：王宏伟、孙明、王传彬、陈西钊、田克恭。

Ⅰ

书

犌犅／犜２２３３３—２００８

日本乙型脑炎病毒

反转录聚合酶链反应试验方法

１范围

本标准规定了日本乙型脑炎病毒核酸的反转录聚合酶链反应试验的技术要求。

本标准适用于动物脑组织中日本乙型脑炎病毒核酸的检测。

２试剂

２．１变性液（见第Ａ．１章）。

２．２２ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠溶液（ｐＨ４．０）。

２．３酚三氯甲烷异戊醇混合液（见第Ａ．２章）。

２．４２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ。

２．５８ｍｍｏｌ／Ｌ上下游引物混合液（引物序列见第Ａ．３章）。

２．６１０倍ＰＣＲ缓冲液。

２．７１％溴化乙锭（ＥＢ）溶液。

２．８ＴＡＥ电泳缓冲液。

２．９１％琼脂糖凝胶。

２．１０上样缓冲液（见第Ａ．４章）。

２．１１其他试剂：１０Ｕ／μＬＡＭＶ反转录酶、１００ｂｐＤＮＡ分子质量标准物、５０Ｕ／μＬＲＮＡ酶抑制剂、

５Ｕ／μＬ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、异丙醇、７５％乙醇溶液、２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁溶液、ＤＥＰＣ处理过的无菌双

蒸水。

３实验室条件

３．１实验室级别要求

实验室必须为生物安全Ⅲ级（ＢＳＬ３级）实验室。

３．２实验室分区

ＲＴＰＣＲ试验区域分反应液配制区（配液区）、核酸提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→

核酸提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。

３．３实验室应配备的仪器及耗材

３．３．１仪器：分析天平、高速离心机、真空干燥器、ＰＣＲ扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫

外分析仪）、液氮罐或－７０℃冰箱、微波炉、组织研磨器、－２０℃冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程分

别为２μＬ、２０μＬ、２００μＬ、１０００μＬ）。

３．３．２耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、１０ｍＬ一次性注射器、１．５ｍＬ灭菌离心管、０．２ｍＬ薄壁ＰＣＲ

管、琼脂糖、５００ｍＬ

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