降钙素基因相关肽与运动性疲劳的潜在关系,运动生物化学论文

降钙素基因相关肽与运动性疲劳的潜在关系,运动生物化学论文原标题：降钙素基因相关肽对大鼠运动性疲惫的影响内容摘要：目的：讨论降钙素基因相关肽〔CGRP〕对大鼠运动性疲惫的影响。方式方法：成年健康雄性SD大鼠，根据不同的预处理措施随机分成5组：空白对照组、磷酸盐缓冲液〔PBS〕预处理组、CGRP预处理组、辣椒素〔CAP〕预处理组、CAP预处理+CGRP预处理组，各组动物在平静状态时、运动80min时和运动至力竭后即刻处死。然后用免疫组化和放射免疫方式方法检测上述条件下大鼠腓肠肌神经肌肉接头CGRP的表示出变化；用苏木精-伊红〔HE〕染色观察上述条件下运动性疲惫大鼠骨骼肌形态构造的变化；用化学比色的方式方法检测上述条件下骨骼肌超氧化物歧化酶〔SOD〕、谷胱甘肽过氧化物酶〔GSH-PX〕、过氧化氢酶〔CAT〕及丙二醛〔MDA〕的变化。结果：1〕给予CGRP预处理后，大鼠运动至力竭的时间明显缩短〔P0.05〕，而给予CAP预处理后大鼠运动至力竭的时间明显延长〔P0.05〕；2〕CGRP免疫组织化学和放射免疫结果显示，CGRP的免疫阳性产物在肌纤维纵切面上，其形状为椭圆形或棒状，主要分布于肌纤维膜的外表。给予CGRP预处理后，大鼠腓肠肌神经肌肉接头CGRP的表示出明显升高〔P0.05〕，而给予CAP预处理后，大鼠腓肠肌神经肌肉接头CGRP的表示出明显下降〔P0.05〕；3〕HE染色显示，平静状态下各组骨骼肌的形态构造未见明显改变；与平静状态相比，运动80min时除CGRP预处理组骨骼肌的细胞核明显增加、增大外，其余各组均无明显改变；力竭运动后即刻与平静状态下相比，除CAP预处理组无明显改变外，其余各组骨骼肌的细胞核均明显增加、增大；4〕化学比色结果显示，给予CGRP预处理后，大鼠骨骼肌中SOD、GSH-PX和CAT的活性明显下降〔P0.05〕，MDA的含量明显上升〔P0.05〕，而给予CAP预处理后大鼠骨骼肌中SOD、GSH-PX和CAT的活性明显上升〔P0.05〕，MDA的含量明显下降〔P0.05〕。结论：CGRP加剧了运动性疲惫的产生。本文关键词语：降钙素基因相关肽；运动性疲惫；骨骼肌；自由基运动性疲惫是机体对运动训练刺激所产生的一系列综合性复杂反响，易导致骨骼肌系统损伤，神经内分泌系统、心血管系统等功能障碍，机体的运动能力下降[7,19,28,32].运动性疲惫的产生不仅与中枢神经系统没有足够的运动神经元驱动有关，而且与神经肌肉接头传递的失败及周围肌肉代谢水平的改变有关。因而，神经肌肉接头是运动性疲惫在外周产生的一个重要位点。当前，有关运动性疲惫与神经肌肉接头的研究主要集中于突触前和突触后[27,31].在突触前其可能存在的机制有：Ca2+内流的下降；Ca2+对神经末梢囊泡释放敏感性的下降；可利用的囊泡数量下降。在突触后其可能存在的机制有：乙酰胆碱受体〔AChR〕的脱敏；肌纤维膜兴奋性的下降。自从在脑、脊髓运动神经元和运动神经末梢检测出降钙素基因相关肽〔calcitoningene-relatedpeptide,CGRP〕后，CGRP在神经肌肉接头作为一种神经调质和/或营养补剂就被广泛研究[5,10,20,25].CGRP被输送到神经肌肉接头的神经末梢后储存在致密核心小泡〔LDCV〕[6,15],以Ca2+依靠方式伴随神经刺激而释放[10,22,30],进而影响肌肉的代谢、构造和功能特征。因而，CGRP的变化将导致该神经所支配骨骼肌的代谢、构造和功能特征的改变[24].研究表示清楚，CGRP有双重效应,正常生理条件下CGRP的释放对靶组织起营养作用，能够扩张周围血管，促进AChR的合成，并对睾丸下降、胃肠活动、胃酸分泌等有良好的成效，并能抑制活性氧自由基的产生和缓减组织的氧化应激，对组织起内源性的保卫作用，然而，在应激或病理条件下，CGRP也能直接或间接的导致脊髓、骨骼肌兴奋性的改变和炎症的发生，对组织造成损伤[12,17].有关CGRP与运动性疲惫的关系，Homonko等和Theriault〔1997〕等的研究表示清楚，一次性大强度的运动可导致大鼠后肢运动神经元CGRP显着提高[13];另有研究表示清楚，在运动经过中骨骼肌CGRP的改变与运动和/或骨骼肌的缺血缺氧有关[4],这提示，CGRP可能与运动性疲惫的产生有关，但CGRP在运动性疲惫大鼠神经肌肉接头的生理和生物学角色当前仍不清楚。本研究通过一次性运动至力竭疲惫动物模型，运用免疫组化、放射免疫、苏木精-伊红〔hematoxylin-eosin,HE〕染色和化学比色的方式方法并结合补充外源性的CGRP和皮下注射CGRP耗竭剂的方式方法检测CGRP对大鼠运动至力竭时间、骨骼肌的形态构造、酶的活性和自由基代谢的影响，探寻求索CGRP与运动性疲惫之间的潜在关系。1材料和方式方法1.1实验动物与主要试剂成年健康雄性SD大鼠150只，体重200~250g,购自湖南农业大学动物科学学院，所有动物经一般体查均无异常。所有大鼠都置于同一动物房，分笼饲养，室温16~22℃，相对湿度45%~55%,正常昼夜节律，自由饮食。CGRP、辣椒素和多克隆兔抗CGRP抗体均购于Sigma公司，骨骼肌超氧化物歧化酶〔superoxidedismutase,SOD〕、谷胱甘肽过氧化物酶〔glutathioneperoxidase,GSH-PX〕、过氧化氢酶〔catalase,CAT〕及丙二醛〔malondialdehyde,MDA〕均购于南京建成生物工程研究所，CGRP放射免疫试剂盒购于北京东亚放免技术研究所。1.2动物模型制备动物模型的制备根据Bedford[3]所建立的疲惫运动模型，采用一次性大强度电动跑台运动至力竭的方式，即水平跑速为28m/min〔超过90%VO2max〕，运动至力竭。力竭判定标准为连续给予大鼠机械刺激后，大鼠不能继续跑动，下跑台后伏地喘息，暂时无逃避反响。在进行正式实验前，大鼠天天进行一次适应性低强度〔跑台坡度为0，速度10m/min,持续时间为10min〕跑台训练，共训练3天，然后进行一次预备的力竭性运动训练，根据动物运动至力竭的时间剔除运动能力太差和运动能力太强的大鼠后随机分组，休息10天后进行正式实验。1.3实验动物分组将150只大鼠根据不同的预处理措施随机分成5组：空白对照组、PBS预处理组、CGRP预处理组、CAP预处理组、CAP预处理+CGRP预处理组，各组大鼠在平静状态时、运动80min时和运动至力竭后即刻处死。1.4PBS、CGRP和CAP的预处理大鼠皮下注射PBS、CAP、纯化的大鼠CGRP.PBS预处理组、CGRP预处理组和CAP预处理组于力竭运动前4天两次皮下给予PBS〔每次300l〕、CGRP〔每次120g,300lPBS溶解，Sigma〕和CAP〔每次50mg/kg,溶于10%无水酒精+10%吐温-80+80%生理盐水中〕。CAP预处理+CGRP预处理组于力竭运动前8天的前1~4天两次皮下给予CAP〔每次50mg/kg,溶于10%无水酒精+10%吐温-80+80%生理盐水中〕，后5~8天两次皮下给予CGRP〔每次120g,300lPBS溶解，Sigma〕。1.5组织制备各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛〔4ml/kg〕，待麻醉后快速取左侧腓肠肌内侧头，除去外表的凝血及结缔组织，经冰冷生理盐水洗涤几次，用滤纸吸干水分，用做放射免疫分析的标本放入1ml0.1M冰醋酸在手动匀浆管中冰浴匀浆研磨，用做酶活性和自由基检测的标本按1g组织中参加10mL冰盐水的比例作为匀浆介质在手动匀浆管中稀释，并匀浆研磨，再经4℃3000r/min离心10min,取上清液储存于-20℃冰箱保存待测。用作免疫组织化学染色和HE染色的组织，在上述大鼠麻醉快速取下左侧腓肠肌内侧头后，开胸经左心室插管入升主动脉，先灌以生理盐水〔150ml〕，继之以4%多聚甲醛磷酸缓冲液〔500ml,pH7.4,4℃〕灌注固定，先快后慢。取右侧腓肠肌内侧头，剔除筋膜，入一样的灌注液4℃后固定过夜，0.01MPBS充分洗涤后，OCT包埋于-80℃保存备用。1.6CGRP免疫组织化学染色标本于-80℃冰箱取出后，-20℃三顿恒低温切片机切片，片厚200m,进行CGRP免疫组织化学染色，采用漂浮法，主要经过如下：1〕切片用0.01MPBS〔pH7.4〕振动漂洗3次，每次10min;2〕入含0.3%的甲醇双氧水，20min;3〕0.01MPBS〔pH7.4〕振动漂洗3次，每次10min;4〕入5%正常小牛血清白蛋白〔BSA〕室温封闭2h;5〕入1∶1000的多克隆兔抗CGRP抗体〔Sigma〕4℃孵育过3夜；6〕0.01MPBS〔pH7.4〕振动漂洗3次，每次10min;7〕入1∶200生物素化山羊抗兔IgG〔Vector〕37℃孵育2h;8〕0.01MPBS〔pH7.4〕振动漂洗3次，每次10min;9〕入1∶200ABC复合物〔Vector,预先30min配制〕，37℃2h;10〕入0.05%DAB+0.03%双氧水显色，0.01MPBS终止反响、贴片、常规脱水、透明、封片。阴性对照采用正常小牛血清代替一抗，其余步骤与上述一样，结果为阴性。1.7骨骼肌CGRP浓度的测定测定时用0.1M的PBS5倍稀释。按要求依次加样后，充分混匀，室温放置20min后，4℃3000rpm离心25min,取上清液，在计数器上测定CPM数。通过预先编制的程序，直接给出CGRP浓度。1.8HE染色标本于-80℃冰箱取出后，0.01MPBS充分洗涤后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚4m.HE染色按以下步骤进行：常规脱蜡，梯度乙醇脱水后行HE染色。苏木精液染色6min,流水冲洗，1%盐酸处理3s,稍水洗，1%氨水返蓝5s,流水冲洗，0.5%伊红液染色3min,稍水洗，80%、90%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。1.9SOD、GSH-PX、CAT活性测定及MDA含量测定SOD、GSH-PX、CAT的活性及MDA的含量测定采用比色法，组织蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。详细操作如下：1〕取样品参加干净试管中，依次参加各试剂，混匀，95℃或37℃水浴，参加中止液；2〕蒸馏水调零，测定吸光度OD值；3〕空白管用蒸馏水代替样品，标准管用标准液代替样品，其他步骤一样；4〕根据样品、空白管、标准管在分光光度计