微生物耐药基础与临床之细菌耐药性的形成机制

细菌耐药性的形成机制生物被膜（五）

五抗菌药物的使用与细菌耐药性的形成

人类提取这种抗生物质即抗生素（可能含有抗生素产生菌的耐药基因）人类开发新抗生素细菌不断受到选择压力抗生素与细菌不断在新基础上相互作用自然界抗生现象细菌产生抗生物质细菌自我保护

细菌基因突变或获得耐药基因细菌对所接触的抗生素产生耐药性

细菌不断发生变异

细菌发展为高耐药菌与多重耐药菌基因突变获得外源基因耐药菌的播散诱导筛选抗生素的生产和广泛应用为细菌耐药埋下了伏笔。细菌是如何形成耐药性的？主要内容一、细菌的遗传物质二、细菌耐药性形成的遗传机制三、细菌适应性耐药四、抗菌药物在细菌耐药性形成中的作用6一、细菌的遗传物质71、细菌染色体bacterialchromosome由一条超螺旋的闭环dsDNA分子组成，附着在横隔中介体或细菌膜上。染色体无组蛋白包绕，不形成核小体结构。细菌染色体上的基因为连续的，无内含子，转录后形成的mRNA不必再剪切、拼接，可直接翻译成多肽。8AmapoftheE.coligenome,showingselectedgenes.©2003JohnWileyandSonsPublishers9例：E.coli的染色体2001年10月15日完成了E.coliK12菌株的基因组全序列测定。DNA双链长约1333um总共4639221bp，4279个蛋白质编码基因，115个编码rRNA和tRNA的基因。（GenBank编号:U00096）是菌体长度的1000倍，可以想象这样长的DNA链，在不到1μm的核区空间内，一定是以十分精巧的空间构建盘绕在细胞内。

©2003JohnWileyandSonsPublishers102、质粒(plasmid)：质粒是存在于染色体以外的遗传物质，细胞质中的闭合的环状dsDNA。

约1Kb～250Kb大质粒：含几百个基因小质粒：含几十个基因11质粒的基本特性能自我复制，自主复制编码细菌某些特定性状

可自发消除

可在细菌间转移

相容性和不相容性紧密型质粒松弛型质粒并非细菌生长所必需，但有利于细菌的生存。接合性质粒非接合性质粒12致育质粒（fertilityplasmid，F质粒）耐药质粒毒力质粒（virulenceplasmid，Vi质粒）

编码毒力相关因子，如ST质粒细菌素质粒如Col质粒代谢质粒（降解质粒）几种重要的质粒13致育质粒（fertilityplasmid，F质粒）编码性菌毛接合型质粒有三个主要功能区自主复制区、转移基因群区、重组区F＋菌（雄性菌）F—菌（雌性菌）14

耐药性质粒

（drug-resistanceplasmid）编码细菌耐药相关性状接合型耐药质粒，称R质粒，可通过接合方式在细菌间转移的耐药质粒。非接合型耐药质粒，称r质粒，不能通过接合方式在细菌间转移的耐药质粒。15耐药决定子（编码耐药性）R质粒由两部分构成耐药转移因子（编码菌毛）16细菌基因组中可移动的基因元件转座因子整合子在细菌细胞内移动173、转座因子transposableelement是指基因组中能够改变自身位置的一段DNA片段。（jumpinggene）位置的改变：转位行为的意义：能使DNA发生插入突变和广泛的基因重排。→变异和进化。染色体质粒18插入序列（insertionsequence,IS）最小的转座因子，＜2kb。包含转位酶基因、反向重复序列转座子（transposon,Tn）＞2kb，携带转位酶基因，耐药性基因、抗金属基因、毒素基因等。与细菌的多重耐药性有关。

抗性基因转座因子的种类ISIS转位酶基因19常见的转座子转座子携带耐药或毒素基因Tn1Tn2Tn3AP（氨苄青霉素）Tn4AP、SM（链霉素）、Su（磺胺）Tn5Km（卡那霉素）Tn6KmTn7TMP（甲氧苄氨嘧啶）、SMTn9Cm（氯霉素）Tn10Tc（四环素）Tn551Em（红霉素）Tn971EmTn1681大肠埃希菌（肠毒素基因）

Integronsaregeneticelementthatcanintegratebysite-specificrecombination,andexpressgenecassettes,usuallyantibioticresistancegenes.StokesHW，HallRM．ANovelfamilyofpotentiallymobileDNAelementsencodingsite-specificgeneintegrationfunctions：integrons．Microbial，1989．具有位点特异性重组功能，能捕获和整合外源基因，并可启动所携带基因的表达的DNA片段。4、整合子（integron，In）细菌基因捕获和表达的遗传单位具有位点特异性重组功能，能识别并捕获移动性基因盒(常携带耐药基因)；可启动所携带基因的表达。又称整合子—基因盒系统

integron-genecassettessystem可存在于质粒、转座子或染色体上。整合子（integron，In）225’3’intIgene2gene1整合子结构示意图attIABCP1P2P5´3´geneRYYYAACGTTRRRYattCattC5’端保守区（5CS）3’端保守区（3CS）中间的可变区域：1个或多个基因盒组成5CS：intI基因编码整合酶integrase，催化基因盒整合至具有同源性的短序列（attI或attC）之间外源基因整合位点attI

两个启动区域

P1、P2根据intI基因的不同，可将In分为六类整合酶启动子可变区启动子由3个ORF组成

qacE1编码季胺类化合物耐药性

sul1编码磺胺类药物耐药性

ORF5

功能不明3CS：25基因盒（genecassettes）：可移动的小分子DNA，有由一个结构基因和一个特异性重组位点attC组成attC的两端为7个bp的回文序列目前发现的基因盒携带的基因绝大多数为

耐药基因。geneattC基因盒有两种存在形式：

geneattCgeneattC整合状态的线性分子游离状态的环状分子attIintIPantPintIntegrasegene+resistancegene1Int+resistancegene2IntR1R2R1R1SchematicrepresentationofthemodelforcassetteexchangeandexpressionTheepidemiologyofintegrons整合子类型1类整合子 2类整合子 3类整合子 超级整合子

菌种

肠杆菌科 肠杆菌科 铜绿假单胞菌霍乱弧菌

铜绿假单胞菌 不动杆菌属 粘质沙雷菌 假单胞菌属 不动杆菌属 铜绿假单胞菌 木糖氧化产碱杆菌黄单胞菌属 霍乱弧菌 恶臭假单胞菌亚硝化单孢菌属 空肠弯曲菌 肺炎克雷伯菌 谷氨酸棒状杆菌 粪肠球菌 基因盒相关耐药β内酰胺类耐药 氨基糖苷类耐药 β内酰胺类耐药 ???? A,C,D类β内酰胺酶 3″2腺苷酰基转移酶 氨基糖苷类耐药

B类β内酰胺酶 链丝菌素耐药 6-转乙酰酶

氨基糖苷类耐药 转乙酰酶

6′－转乙酰酶 磺胺耐药

3－转乙酰酶 A类和

2－腺苷酰基转移酶 二氢叶酸还原酶

3－腺苷酰基转移酶 氯霉素耐药 转乙酰酶 非酶作用机制 磺胺耐药

A类和B类二氢叶酸还原酶 利福平耐药

ADP-核糖基转移酶 红霉素耐药 季铵类化合物耐药整合子的移动整合子存在于质粒、转座子或染色体上，可随转座子在染色体和质粒间移动；可随质粒在细菌间转移。基因盒可以被切除和整合。在细菌耐药播散中发挥重要作用。在细菌多重耐药的形成中发挥重要作用。30中国人兽共患病学报，2006,22(9)。中国抗生素杂志，2007年12月第32卷第12期

耐药基因

IR转位酶基因

IR插入序列（IS）

IR转位酶基因

IRSul1intI1attI1耐药基因

attcqacE△1ORF5整合子整合子与转座子的比较：

IR转位酶基因

IR转位子（Tn）：整合子与转座子的比较：整合子是缺陷转座子：整合子缺少转座基因，不能启动自身转移（只能移动基因盒），基因盒不以反向重复序列为界整合子是转座子的变体：整合子可以启动耐药基因的表达，移动的基因盒更广泛、携带的基因盒更多。整合子在细菌多重耐药的形成、耐药基因的播散中发挥重要作用。33溶原性细菌温和噬菌体前噬菌体prophage:整合在细菌基因组中的噬菌体基因组转座噬菌体34温和噬菌体能整合到细菌染色体的任一位置，能改变细菌的某些生物学性状。如大肠埃希菌温和噬菌体Mu（mutatorphage，诱变噬菌体）。可作为生物诱变剂，研究细菌变异的工具。5、噬菌体基因组二、细菌耐药性形成的遗传机制

固有耐药性（intrinsicresistance）

特点举例获得耐药性（acquiredresistance）产生的方式基因转移的方式基因转移的元件及介导的耐药（一）固有耐药的遗传机制由种属特异性决定，有些微生物具有一些独特的结构或代谢，对药物天然不敏感。如支原体无细胞壁结构，对β内酰胺类抗菌药物天然不敏感；常见革兰阴性杆菌外膜上的孔蛋白通透性极低，对氨苄青霉素耐药率为100％。嗜麦芽寡养单孢菌产生金属β内酰胺酶及丝氨酸活性酶（两者均为可诱导酶），对亚胺培南和氨曲南耐药率为100％。（二）获得性耐药的遗传机制1.

基因突变2.获得外源基因基因突变是自发的、随机的，自发突变率低：10-10～10-7或10-16～10-10耐药突变株的形成是自发突变加上药物选择的结果。由基因突变引起的耐药性，一般对一种或两种相类似的药物耐药。突变若发生在染色体上，则可代代相传。突变若发生在质粒上，则可细菌间广泛传播。1、基因突变染色体上的基因能否转移到质粒上？

基因突变引起的耐药

喹诺酮类抗生素耐药：染色体上编码DNA回旋酶的gyrA基因、qnrA基因突变，引起DNA回旋酶A亚基变构，使其对quinolones的亲和力降低。近期报告质粒携带该突变基因norA基因高表达，其介导的主动泵蛋白表达增多，使quinolones在菌体内积蓄减少。近期报告金黄色葡萄球菌有质粒携带norA基因，有可能造成耐药性的迅速蔓延和扩散。研究论文Tapasll的研究：

9株淋球菌：其中4株氟喹诺酮耐药耐药菌株均存在GryA基因91位点上丝氨酸（Ser）→苯丙氨酸（Phe）的突变，而所有敏感菌株则无一突变。Onodera的研究：对氟喹诺酮耐药的淋球菌GryA基因上的另外两个位点的突变：Ser83→Phe，天冬氨酸（Asp）87→甘氨酸（Gly）。gyrA基因突变使DNA回旋酶对quinolones的亲和力降低。TapasllJMetal.SexTransmDis,1996;23(5):425基因突变引起的耐药

β内酰胺类抗生素耐药ESBLs：主要由β-内酰胺酶基因(TEM和SHV等)点突变而来，已报道的TEM类ESBIs已有90多种，SHV类ESBLs多于25种。

由质粒介导AmpC酶：与连续的基因ampC、ampR、ampG、

ampD有关。调节基因的突变率高。由染色体或质粒介导金属酶：IMP、VIM、NDM-1金属酶基因。

染色体和质粒介导异烟肼（isoniazed）是前体药物，可被结核分枝杆菌内过氧化氢酶一过氧化物酶激活，进而可抑制细胞壁分枝菌酸的生物合成。过氧化物酶基因

katG

突变代谢标记和蛋白质组学研究发现与异烟肼作用有关的结核分枝杆菌分子包括InhA,AcpM,KasA,AhpC,Ag85复合物等。这些分子可能是异烟肼的靶标。已经发现至少有5种不同基因的突变与异烟肼耐药性相关(katG、inhA、ahpC、kasA和ndh)。结核杆菌耐药与基因突变结核杆菌耐药与基因突变利福平(rifampin)耐药株：

RNA聚合酶B亚基的编码基因rpoB突变链霉素(streptomycin)耐药株：核糖体蛋白编码基因rpsL

或16SrRNA编码蛋白突变吡嗪酰胺耐药株：吡嗪酰胺→吡嗪酸（毒性）编码吡嗪酰胺酶的基因pncA突变乙胺丁醇(ethamabutol)耐药株：乙胺丁醇的靶位阿拉伯糖基转移酶（细胞壁合成）阿拉伯糖基转移酶的编码基因embB

操纵子突变结核菌耐药基因突变检测液芯关于耐药基因转移元件形成的推测：单个基因自发突变耐药基因其mRNA逆转录产物作为基因盒被细菌染色体上的整合子捕获多个耐药基因被捕获，形成多重耐药

转座子转位至质粒，导致R质粒的形成整合子两端插入IS转变为转座子多重耐药菌株的形成？耐药基因的广泛播散？由基因突变引起的耐药性，一般仅对一种或两种相类似的药物耐药。巴斯德学院细菌学家的解释：耐药基因可以由染色体转移到质粒，由质粒转移到染色体，由一个质粒转移到另一个质粒，

由一个细菌转移到另一个细菌。这是基因的传染病。获得外源耐药基因是微生物发生耐药性变异的主要原因。利于播散稳定遗传细菌间基因的友好分享细菌间基因转移与重组：2、获得外源耐药基因供体菌受体菌耐药基因基因转移：外源性的遗传物质由供体菌转入某受体菌细胞的过程。基因重组：转移的基因与受体菌DNA整合在一起。重组使受体菌获得供体菌的某些性状。同源重组：发生在紧密相关的DNA之间（取代）非同源重组：发生在无关的DNA之间（插入）

根据DNA片段的来源与转移的方式的不同，

细菌间基因转移与重组方式有四种：转化(transformation)

转导(transduction)接合(conjugation)溶原性转换（lysogenicconversion

）前噬菌体噬菌体lysogenicconversion噬菌体（染色体或质粒DNA）供体菌transduction

性菌毛（质粒，或染色体DNA）供体菌conjugation直接摄取（裸露DNA）供体菌transformation基因转移载体或方式基因来源

方式基因的转移和重组方式的比较

转化(transformation):游离的耐药基因DNA片段：

抗生素产生菌的耐药基因片段耐药菌溶解后释放出的耐药基因片段，耐药基因直接进入敏感菌（感受态时）内，与敏感菌的基因发生重组，使敏感菌成为耐药菌。常见于G-菌间。52

转导(transduction)

53供体菌受体菌转导噬菌体供体菌DNA噬菌体DNA普遍性转导(generalizedtransduction)供体菌任何DNA片段都可能被误装入噬菌体内，而被转入受体菌中（10－6）

，故称普遍性转导。借助于噬菌体将耐药基因转移给敏感菌，由于噬菌体有特异性，且通过噬菌体传播的DNA量很少，因此耐药性的转导现象仅能发生在同种细菌之间，通常仅能传递对一种抗菌药物的耐药性。是金黄色葡萄球菌耐药性转移唯一的方式。

转导(transduction)

55接合(conjugation)接合是细菌的遗传物质（主要是质粒DNA）通过性菌毛从供体菌转移至受体菌的方式。能通过接合转移的质粒称为接合性质粒，如F质粒和R质粒。

由接合传递的耐药性也叫感染性耐药，接合转移不仅可在同种菌之间进行，也可在属间不同种菌之间进行，通过接合方式，一次可完成对多种抗菌药耐药性的转移。主要出现在G－细菌中，特别是在肠道菌。57例：F质粒的接合致育质粒F＋菌F—菌Hfr菌（高频重组株）：染色体上带有F质粒基因的细菌F’：带有染色体基因的F质粒Hfr菌株高频重组菌F′质粒：带有染色体基因的F质粒接合：F＋×F－→F＋，F＋→Hfr×F－→Hfr×F－受体菌获得供体菌染色体部分基因的重组子F′×F－→F′，F′

受体菌获得供体菌染色体的基因Hfr菌株：染色体上带有质粒基因F′质粒：带有染色体基因的F质粒染色体耐药基因质粒耐药基因在细菌间及染色体和质粒之间的转移耐药基因

在细菌内的移动及在细菌间的转移耐药基因在细菌之间的转移基因元件：游离DNA、质粒、染色体片段

耐药基因在染色体和质粒中间的转移基因元件：转座因子、整合子，质粒携带耐药基因的基因转移元件（游离DNA片段、质粒、转座子、整合子、染色体）通过转化、转导、接合等方式由供体菌转移到受体菌中，细菌以此获得外源性耐药基因，形成耐药株或多重耐药株。耐药基因也因此在细菌间广泛传播。供体菌受体菌耐药基因耐药基因的转移细菌间基因的友好分享GeneticelementscarryingmobilegenesinbacteriaGenecassetteIntegronTransposonPlasmidIntegration/excisionChromosomeIntegration/excisionPhageinfectionProphageIntegration/excisionLysisDNA耐药株被筛选，并由劣势菌成为优势菌三、细菌的适应性耐药

没有特定的基因改变，变异发生在转录水平，即耐药表型突变。耐药基因的调控机制群体感应系统：生物被膜的形成

抗菌药物诱导的耐药表型突变-内酰胺类抗生素：

诱导

-内酰胺酶产量增加激活金葡菌mecR1基因，产生PBP2a，

对甲氧西林等-内酰胺耐药四环素，氯霉素等：

诱导大肠杆菌marA基因表达，多重耐药。耐药基因的调控机制

大肠杆菌主动外排系统的表达受Mar操纵子调控。

甲氧西林耐药性的表达调控基因（mecRI、mecI

）及其辅助基因（femA、femB、femC、femD）。这些基因的协同就使得MRSA对β-内酰胺类具有更高度耐药性。群体感应系统细菌密度感应系统71群体感应系统

调控细菌生物被膜的形成耐药表型突变株四、抗菌药物在耐药性形成中的作用抗菌药物压力是细菌耐药性形成的主要推手抗生素的诱导作用，提高突变率（基因突变是随机的）抗生素的筛选作用（表型筛选是定向的）

抗生素双刃剑杀菌？筛选耐药株

抗生素的诱导作用提高基因突变率耐药表型突变株-内酰胺类抗生素

-内酰胺酶产量-内酰胺类抗生素

激活金葡菌mecR1产生PBP2a 对甲氧西林耐药四环素，氯霉素等

诱导大肠杆菌marA基因表达 多重耐药耐药菌株：抗生素耐药基因突变株的筛选作用长期、不合理使用抗生素：劣势菌优势菌敏感菌株：优势菌劣势菌自然界的一般情况下：药物使用剂量增加：

上世纪五六十年代青霉素一次剂量是2万～4万单位，现在几十万、几百万单位。耐药株的出现：

环丙沙星20年前开始在临床上应用，当时副作用小、疗效好，现在几乎对60％以上的病人失