组织病理学制片技术

Notice1.上课请关手机（或调成振动，接电话到室外）。2.选修课自愿选择，试听一次，下次课班长提交选修课学生名单(包括email)。3.学分问题⑴平时表现如：纪律、问答、作业。⑵结课测验?⑶对本课程的意见和建议；组织病理学制片技术

Histopathologic

technology生命科学研究中心邢立强2目的和要求

AimsandRequirements了解生物组织的特点及取材的注意事项；熟悉切片的原理、一般要求及注意事项；掌握石蜡切片制作技术；病理学常用的观察手段

Thecommonsurveymeansinpathology1、大体标本观察：主要用肉眼、量尺及各种衡器等辅助工具，对所检标本的大小、形状、色泽、重量、表面及切面、病灶特点进行观察及测量。2、组织切片的观察：取正常或病变组织进行切片、染色(HE染色最常用)在显微镜下进行观察。病理学标本的种类

Typesofpathologicsamples1、活体组织检查(Biopsy)：简称活检，从患者活体局部切取、钳咬、细针吸取和摘取等手术方法获取病变组织进行病理检查。2、脱落细胞学检查(Exfoliativecytologicalexam)：对患者痰液、胸腹水、尿液以及阴道刮片、食管拉网、纤维胃/支气管镜所取得的材料进行涂片，以检查脱落细胞，是早期发现和诊断肿瘤的好方法。3、尸体解剖(Autopsy)：通过尸检可查出病因和病变，及时发现和确诊某些传染病、新发现的疾病，积累经验，提高诊疗水平。4、动物实验(Animalexperiment)：根据研究需要，在动物身上复制人类某些疾病的模型、进行观察研究，了解疾病的病因、发病机制及药物疗效等。5、组织/细胞培养(TissueandCellculture)：将某种组织或单细胞在适宜的培养基中体外培养，来研究各种病因作用下组织、细胞的病理变化及治疗效果。病理技术的应用Applicationofpathologictechnique帮助临床查明死因(尸检);手术后病变标本，明确诊断(临床活检);为教学、科研提供资料;取材(Samplecollection)→固定(Fixation)→脱水(Dehydration)→透明(Transparentizing)→浸蜡(Paraffinsoaking)→包埋(Embedding)第一节组织处理

Tissueprocessing

1.人为因素

2.标本大小

3.取材时间

4.包埋方向

5.边缘标记一、取材(Samplescollection)6.小标本的处理方法

7.特殊情况取材

8.取材数量

9.清除多余成分10.重复取材11.核对取材12.剩余组织存放二、固固定(Fixation)固定就就是用用物理理或化化学方方法，，阻止止组织织细胞胞离体体或培培养细细胞脱脱离生生存环环境后后发生生形态态学变变化。。(一)固定的的目的的1.迅速阻阻断组组织细细胞离离体后后的自自溶性性变化化，防防止腐腐败，，尽量量保持持组织织细胞胞生活活状态态下的的形态态结构构。2.使细胞胞内的的蛋白白质、、脂肪肪、糖糖、酶酶等成成分转转变成成不溶溶性物物质，，并保保持原原有的的空间间位置置。3.固定剂剂有硬硬化作作用,增加组组织的的硬度度,便于制制片。。4.组织中中的各各种物物质经经固定定后产产生对对染料料的亲亲和力力，利利于染染色和和观察察。（二））常用用的固固定方方法1.浸泡固固定法法2.灌注固固定法法3.细胞涂涂片的的固定定方法法4.微波固固定法法5.蒸气固固定法法（三））常用用的固固定液液1.单纯固固定液液(1)甲醛(formaldehyde)(2)酒精(alcohol)(3)苦味酸酸(picricacid)(4)丙酮(acetone)(5)醋酸(aceticacid)2.混合固固定液液(1)Bouin液：：用于于结缔缔组织织及脂脂肪染染色；；(2)Zenker液：常常用于于三色色染色色；(3)4%多聚甲甲醛-磷酸二二氢钠钠-氢氧化化钠液液；（四））固定定后的的处理理1.一般固固定液液(甲醛等等)固定组组织后后，用用流水水冲洗洗以清清除组组织内的的固定定液终终止固固定。。2.含有乙乙醇、、乙酸酸及苦苦味酸酸的固固定液液，组组织固固定后后不需需要或或不能能用水水冲洗洗。3.含有铬铬酸、、重铬铬酸钾钾和锇锇酸的的固定定液，，组织织固定定后应应充分分水洗洗，一一般为为12~24h。4.用含汞汞的固固定液液固定定组织织后，，要进进行脱脱汞处处理，，可在在组织织脱水水前或或切片片染色色前进进行，，一般般多在在染色色前脱脱汞。。其方方法为为切片片脱蜡蜡入水水后，，入0.5%碘乙醇醇5~10min，水洗洗后再再入3%~5%硫代硫硫酸钠钠或95%乙醇1~2min，再充分水水洗，蒸馏馏水洗后进进行染色。。（五）固定定时的注意意事项1.标本应应新鲜并及及时取材，，快速放入入固定液中中。特殊标标本应单独独固定和存存放。2.固定液的用用量一一般固定液液用量为组组织块体积积的10~20倍，贵重的的固定液不不少于3~5倍。避免组组织紧贴容容器底部，，影响固定定效果。对对于特殊染染色的组织织(如神经染色色及酶组织织化学染色色等)固定时应考考虑组织块块的大小、、固定液种种类、固定定时间和温温度等。酶酶组织化学学染色组织织的固定应应置于冰箱箱4℃固定。3.防止组织变变形柔柔软或较薄薄的组织先先平铺在吸吸水纸上，，再投入固固定剂中；；含气或脂脂肪多的组组织易浮于于液面，可可在组织表表面覆盖棉棉花以达到到充分固定定。4.固定液的穿穿透性一一般固定定液在24h内不能穿透透厚度大于于2~3mm的实体组织织或5mm的多孔疏松松组织，故故取材组织织块的厚度度原则上不不应超过3~4mm。5.固定时间固固定的的时间与固固定液的种种类、组织织类型、块块大小、温温度等有关关。一般1.5cm×1.5cm×0.2~0.3cm大小的组织织块,固定时间为为12~24h。6.固定温度大大多数数可在室温温(25℃)固定，在低低温(如4℃)固定时，固固定时间要要相应延长长。三、脱水(Dehydration)组织经固定定和水洗后后含大量水水分，水与与石蜡不能能混溶。因因此在浸蜡蜡和包埋前前，必须进进行脱水。。常见的脱水水剂有乙醇醇、正丁醇醇、丙酮等等。为防止水份份丢失过快快，造成组组织变形，，一般采用用梯度脱水水法。也就就是使脱水水剂的浓度度逐渐升高高，脱水过过程尽量缓缓和，减少少组织变形形。四、透明(Transparentizing)常用的透明明剂有二甲甲苯、苯、、甲苯、氯氯仿、环己己酮、苯甲甲酸甲酯、、香柏油、、冬青油和和苯胺油等等。目前也有用用环己酮作作为透明剂剂，环己酮酮为无色无无毒液体，，可与苯、、二甲苯和和酒精等相相混合，也也可溶解石石蜡。而且且脱水时组组织不收缩缩变硬，用用于快速石石蜡切片效效果较好。。五、浸蜡(Paraffinwaxsoaking)用熔化的切切片石蜡逐逐渐替换组组织中二甲甲苯的过程程。六、组织的的包埋和包包埋方法(Embedding)（一）常规规石蜡包埋埋（二）脱落落细胞标本本的包埋（三）微小小标本的包包埋第二节组组织切片片法(Tissuesectioning)组织切片法法包括石蜡蜡切片法、、冰冻切片片法、火棉棉胶切片法法、树脂包包埋薄切片片法和大组组织石蜡切切片法等。。常用的切切片工具包包括组织切切片机、切切片刀和自自动磨刀机机等。一、组织切切片机和切切片刀1.石蜡切片机机2.火棉胶切片片机3.恒冷箱切片片机4.震动切片机机石蜡切片机震动切片机恒冷箱切片机切片刀切片刀是切切片机的重重要部件，，常见的有有两种：一种为可重重复使用的的钢刀，一一般有4cm、8cm、14cm、18cm、20～24cm等，根据切切片刀的形形态，有平平凹型、深深平凹型、、平楔型、、双凹型。。另一种为一一次性钢刀刀片，是一一种薄型切切片刀片，，用于普通通石蜡切片片。使用时时固定在特特制的刀架架上。各种切片刀刀的剖面图图a平凹形b深平凹形c平楔形d双凹形石蜡切片机机用一次性性钢刀片二、组织切切片(Tissuesectioning)石蜡切片仍仍是目前各各种切片制制作方法中中最常用、、最普遍的的一种方法法。(一)切片前的准准备1.备齐常用器器具,如玻片、毛毛笔和铅笔笔或刻字笔笔。2.检查切片机机的工作状状态,将固件都拧拧紧，检查查切片刀是是否锋利,切片刀质量量是保证切切片的关键键。如果使使用一次性性刀片,应根据切片片情况及时时调整刀刃刃位置。3.清洁玻片的的方法（1）新载玻片片的处理：：先用清洁液液浸泡12~24h,流水充分冲冲洗后,用蒸馏水洗洗3~5遍,95%酒精浸泡2h,用绸布擦干干或用烘箱箱烤干备用用。清洁液液是用重铬铬酸钾和浓浓硫酸按比比例配成的的洗液。常用的有以以下几种配配方：①重铬酸钾钾(g):浓硫酸(ml):蒸馏水(ml)=1:1:10;②重铬酸钾钾:浓硫酸:蒸馏水=2:3:25;③重铬酸钾钾:浓硫酸:蒸馏水=2:5:15。（2）盖玻片的的处理：盖盖玻片可按按以上方法法处理，但但因盖玻片片很薄，以以上处理程程序应缩短短。清洁液液浸泡2h，流水冲洗洗。也可用用以下方法法清洗:盖玻片立排排于卧式染染缸(排2行，中间隔隔以载玻片片)。松紧度以以玻片可轻轻松转动为为好，以下下步骤应保保持液体进进入每个玻玻片间隙，，玻片之间间不能有气气泡。用1%盐酸酒精浸浸泡2h，然后流水水冲洗干净净，再用蒸蒸馏水冲洗洗数次。入入95%酒精浸泡2~3h，无水酒精精浸泡20min，倒掉酒精精放60℃烘箱烤干备备用。（二）切片片制作过程程1.蜡块在冰箱箱中预冷，，然后固定定在切片机机上。将切切片刀装在在刀架上。。调整蜡块块与刀的位位置，使蜡蜡块切面与与刀刃接近近。2.切片机多为为轮转式，，使用时左左手执毛笔笔，右手旋旋转切片机机转轮。先先修出标本本，直到组组织全部暴暴露于切面面为止，标标本过小时时修块应多多加注意，，大标本要要切全。切切出蜡带后后，用毛笔笔轻轻挑起起一端，用用镊子夹起起另一端，，正面向上上放入展片片水槽中(水温一般低低于蜡熔点点10~12℃)，待切片展展平后，即即可进行捞捞片。3.切片时刀是是由下向上上运动，为为得到完整整的切片，，防止组织织出现刀纹纹裂缝，应应将组织硬硬脆难切的的部分放在在上端(如皮肤组织织的表皮部部分，胃肠肠等组织的的浆膜面等等)。4.捞片时注意意组织片的的摆放位置置，尽量整整齐美观。。要留出贴贴标签的空空间，5.捞片时注意意在切片和和玻片之间间不要留有有气泡。捞捞好的切片片应在60℃左右烤箱内内烤至少30min。以防染色色时脱片。。（三）石蜡蜡切片制作作时的注意意事项(Attentions)1.组织的取材材和固定；；2.组织脱水、、透明和浸浸蜡；3.切片组织块块固定不牢牢时；4.切片刀和切切片机；；5.特殊要求切切片的制作作。第三节冰冰冻切片法法(Frozensectioning)冰冻切片可可用于新鲜鲜组织、甲甲醛固定的的组织和低低温冰箱冷冷藏的组织织块等。已已固定的组组织块经流流水冲洗后后再进行切切片。一、冰冻切切片法（一）恒冷冷箱切片机机提前开机预预冷，一般般工作温度度设定在-22℃左右。待刀刀台、样品品台和箱内内达到设置置温度后即即可切片。。顺序如下下：①将组组织用OCT粘在样品托托后放置在在速冻台上上；②组织织冻结后，，将样品托托固定到样样品台上；；③调整组组织切面与与刀刃位置置，初步修修出组织切切面后，放放下防卷板板，关闭观观察窗，开开始切片。。④切出的的切片粘贴贴到载玻片片上，直接接冻存或吹吹干固定。。（二）半导导体制冷切切片机二、冰冻组组织的取材材及保存方方法（一）取材材负责诊断的的医师应亲亲自检查大大体标本，，做多切面面详细检查查，必要时时可在解剖剖镜下观察察。选取最最具代表性性的组织制制片，必要要时应多点点取材。如如切面有特特殊要求，，应向技术术人员说明明。取材和和切片的剩剩余组织须须进一步做做石蜡切片片进行对照照，有利于于病理医师师对照阅片片，不断提提高观察冰冰冻切片的的水平。（二）保存存方法组织速冻的的方法很多多，常用方方法为液氮氮和干冰~丙酮法。1.液氮法：将将组织块平平放于瓶盖盖或标本盒盒等适当容容器内，缓缓慢放入盛盛有液氮的的容器内。。当组织块块冻结后，，取出用铝铝箔包好，，做好标记记后入液氮氮罐或-70℃低温冰箱保保存。可保保存数月至至数年。如如短期内使使用，可保保存于-30℃冰箱。2.干冰-丙酮法：将将组织块放放入盛有OCT包埋剂的标标本盒内，，使组织块块完全浸没没。将丙酮酮倒入盛有有10g干冰的保温温杯调成糊糊状。将装装有组织块块的标本盒盒放入保温温杯，待包包埋剂成白白色冻块时时，取出如如上法保存存。此法组组织速冻快快，组织结结构保存好好。3.异戊烷-液氮法：此此法的优点点可防止冰冰晶破坏组组织细胞的的形态结构构，对含水水较多的组组织适宜用用此法进行行速冻。先先用甲基纤纤维素包埋埋组织块。。将盛有异异戊烷的小小烧杯放入入装有液氮氮的大保温温杯或冰壶壶内，搅拌拌异戊烷待待杯底出现现一层白色色糊状物时时，放入包包埋好的组组织块，数数秒钟即可可取出，按按上述方法法保存。（三）注意意事项1.液氮速冻时时，标本盒盒不能直接接浸入液氮氮，以免组组织膨胀破破碎。2.速冻的包埋埋剂应适量量。3.新鲜组织不不能放入-10℃冰箱内缓慢慢冷却，否否则组织内内水分可逐逐渐析出形形成冰晶，，造成组织织结构破坏坏。4.冷冻后的组组织块应密密封保存，，防止失水水。5.在组织块复复温时，应应在37℃加温速融，，自然复温温将造成组组织结构破破坏。第四节脱脱落细胞胞制片技术术PreparationofExfoliativecytologicsamples脱落细胞标标本包括：：胸水、腹腹水、尿液液、脑脊液液穿刺液和和一些涂片片、刷片及及印片的细细胞，在临临床上具有有非常重要要的诊断价价值。一、细胞标本本的取材细胞标本取材材和制片方法法一般有印片片法、穿刺法法、沉淀法和和活细胞标本本的制备等。。(一)印片法常用于活检和和手术标本，，新鲜标本沿沿病灶中心剖剖开，将载片片轻压于切面面上，吹干后后立即浸入固固定液内5~l0min，取出自然干干燥，低温储储存。优点是是操作简单，，细胞抗原保保存好。(二)穿刺液沉淀法法常用于淋巴结结、软组织、、肝、肾和肺肺等，穿剌液液少，可直接接涂片，细胞胞尽量涂均匀匀。穿刺液多多，细胞丰富富，可置离心心管内，以500rpm低速离心5~l0min，弃上清，将将沉淀制成细细胞悬液(2×105细胞/ml)。涂片镜检,以细胞较密不不重叠为好。。干燥后固定定。胸水、腹腹水、尿液和和脑脊液等如如细胞较少时时，也可用此此方法制片。。此法细胞保保存好，操作作简单。注意意涂片时，尽尽量涂均匀。。(三)单核细胞分离离法主要用于外周周血和胸腹水水中淋巴细胞胞的分离。如如为血性胸腹腹水，经上述述方法分离淋淋巴细胞然后后在37℃培养30min，离心沉淀取取上清，制成成浓度为2×106细胞/ml的细胞悬液，，吸50µl涂片，略干后后固定l0min。2023/1/156宫颈脱落细胞胞涂片见分化不良细细胞体积大、、核深染；正正常上皮细胞胞核小、胞浆浆丰富。二、血涂片的的制作血涂片的显微微检查是血液液细胞学检查查的基本方法法，临床上应应用极为广泛泛，制备厚薄薄适宜、分布布均匀、染色色良好的血涂涂片是血液学学检查的基本本技术之一。。(一)操作步骤1.消毒：先按摩摩取血部位，，使血流通畅畅；再用酒精精消毒采血针针和取血部位位(如指尖)。2.取血：待酒精精干后，刺破破皮肤，使血血自然流出，，勿挤。取干干净载片，让让血滴在离载载片一端中4~5mm处，注意手指指持握载片的的边缘，勿触触及其表面。。不能使载片片接触取血部部位的皮肤。。3.推片：取一张张边缘光滑的的载片。将其其一端置于血血滴前方，向向后移动到接接触血滴，使使血液均匀分分散在推片与与载片的接触触处。然后使使推片与载片片呈30°~40°角，向另一端端平稳地推出出。涂片推好好后，通过摇摇摆使之快速速干燥。4.染色：用特种种玻璃铅笔在在血膜两侧画画两条线，防防止染液外溢溢。再将瑞氏氏染液(伊红-亚甲基蓝)滴在血膜上，，至染液淹没没全部血膜，，染半分钟。。加等量蒸馏馏水(或缓冲液)与染液混合再再染5分钟。最后用用蒸馏水把染染液冲掉，用用吸水纸吸干干，自然干燥燥后，即可观观察。（二）注意事事项活细胞标本制制备中玻片的的清洗：新玻玻片常有游离离碱,因此应用清洗洗液或10%盐酸浸泡24h,然后再彻底清清洗。用过的的玻片可放入入适量肥皂水水或合成洗涤涤剂的清水中中煮沸20min,再用热水将肥肥皂和血膜洗洗去，用自来来水反复冲洗洗,必要时再置95%乙醇中浸泡1h，然后擦干或或烤干备用。。一张良好的的血片，要求求厚薄适宜，，头体尾分明明，分布均匀匀，边缘整齐齐，两侧留有有空隙。血片片制好后最好好立即固定染染色，以免细细胞溶解和发发生退行性变变。三、活细胞标标本的制备多用于科研，，用于常规病病理诊断的较较少。标本主主要来源于建建株的培养细细胞，短期培培养细胞和外外周血等。细细胞可直接培培养在盖玻片片上，固定后后即可进行染染色观察或进进行免疫组织织化学染色或或扫描电镜标标本制备。也也可培养于培培养瓶或培养养板内，制成成细胞悬液，，收集一定的的细胞还可进进行涂片。可可以经离心后后，进行透射射电镜标本制制备。谢谢大家！2023/1/162脱落细胞学学检查采集病变处处脱落细胞胞固定、涂涂片染色后后进行观察察。如：子子宫颈癌、、食管癌、、鼻咽癌—直接采集，，肺癌—自然分泌物物(痰)7.图象分析技技术病理学形态态观察的一一种更为精精确的定量量标准和方方法。主要应用于核形态参参数的测定定(如核直径、、周长、面面积、体积积、形态因因子等)。也用于区别肿瘤的良恶恶性、区别癌前病变和和癌、肿瘤瘤的组织病病理分级和和判断预后后等。还可用于DNA倍体的测定定和显色反反应(如免疫组织织化学)的定量等方方面。632023/1/12023/1/1643、组组织织化化学学和和细细胞胞化化学学的的观观察察：：一般般称称为为特殊殊染染色色，通通过过应应用用某某些些能能与与组组织织细细胞胞化化学学成成分分特特异异性性结结合合的的显显色色试试剂剂，，显显示示病病变变组组织织细细胞胞的的化化学学成成分分(如蛋蛋白白质质、、核核酸酸、、脂脂类类、、糖糖类类等等)。4、免免疫疫组组织织化化学学观观察察：：利用用抗抗原原与与抗抗体体的的特特异异性性结结合合反反应应来来检检测测组组织织中中未未知知的的抗抗原原或或抗抗体体，，借借以以判判断断肿肿瘤瘤的的组组织织来来源源与与分分化化方方向向。。9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。1月-231月-23Sunday,January1,202310、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。14:04:4814:04:4814:041/1/20232:04:48PM11、以以我我独独沈沈久久，，愧愧君君相相见见频频。。。。1月月-2314:04:4814:04Jan-2301-Jan-2312、故人江江海别，，几度隔隔山川。。。14:04:4814:04:4814:04Sunday,January1,202313、乍见翻疑梦梦，相悲各问问年。。1月-231月-2314:04:4814:04:48January1,202314、他乡生白白发，旧国国见青山。。。01一月月20232:04:48下下午14:04:481月-2315、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。。一月232:04下午午1月-2314:04January1,202316、行动出成成果，工作作出财富。17、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。。7:40:33上午7:40上午07:40:331月-239、没有失败，只有暂时停止成功！。1月-231月-23Thursday,January19,202310、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。。07