第章DNA重组技术

第六章DNA重组技术佛山科学技术学院唐冬生广东医学院黄迪南第六章DNA重组技术

DNA重组（DNArecombination）不同来源的DNA，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程。DNA克隆（DNAclone）在体外对DNA分子进行重组，构建成具有自主复制能力的重组DNA分子，再导入宿主细胞进行大量扩增，最终获得大量同一的DNA分子亦称分子克隆或DNA重组技术第六章DNA重组技术第六章DNA重组技术第二节常用载体第三节DNA重组与鉴定第一节常用的工具酶第一节常用的工具酶第一节常用的工具酶

工具酶：DNA重组技术，需要利用一些酶在体外对DNA进行切割、连接等基因操作，这些酶常被称为工具酶。主要的工具酶:限制性核酸内切酶DNA连接酶逆转录酶DNA聚合酶Ⅰ碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶第一节常用的工具酶第一节常用的工具酶

二、DNA连接酶三、分子克隆中常用的其他酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶

简称限制酶，是DNA重组技术的基本工具识别和切割双链DNA分子特异序列的核酸水解酶一、限制性内切酶

（二）命名（三）Ⅱ类限制性核酸内切酶识别序列特点

（四）限制性内切酶的应用

（五）限制性内切酶的活力单位和星号活力

（六）甲基化酶

（一）分类（一）分分类根据酶的的分子组组成及裂裂解方式式的不同同，将限限制性内切酶酶分为三三类：1.Ⅰ类类和Ⅲ类类限制性内内切酶一、限制制性内切切酶兼有修饰饰作用和和依赖于于ATP的限制制活性在DNA重组技技术中并并不常用用一、限制制性内切切酶2.Ⅱ类类限制性内内切酶能识别并并切割特特异性的的核苷酸酸序列通常所说说的限制制性内切切酶即指指此类（二）命命名通常由三三个斜体体字母表表示1.第一一个大写写字母为为微生物物属名的的第一个个字母2.第二二、三个个小写字字母为微微生物种种名的头头两个字字母3.如有有株名则则再加一一个字母母一、限制制性内切切酶一、限制制性内切切酶4.同一一株微生生物发现现几种限限制性内内切酶，，根据其发现和和分离的的先后顺顺序，用用罗马数数字表示示例如:淀粉液化化芽胞杆杆菌（Bacillusamyloliguefaciens）H株第1种限制性性内切酶酶，命名名为BamHⅠ(三)ⅡⅡ类限制制性核酸酸内切酶酶识别序序列特点点切口：：平端切口口--平末末端粘端切口口--粘性性末端GGATCCCCTAGG回文结构构一、限制制性内切切酶BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口口粘端切口口一、限制制性内切切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ1.同功功异源酶酶：来源不同同的限制制酶，能能识别和和切割同同一位点点，这些些酶称同同功异源源酶。一、限制制性内切切酶BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGG

AGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA2.同尾尾酶：有些限制制性内切切酶虽然然识别序序列不完完全相同同，但切切割DNA后产产生相同同的粘性性末端，，称为同同尾酶。。一、限制制性内切切酶（四）限限制性内内切酶的的应用主要应用用：DNA重重组克隆隆及亚克克隆改造和构构建质粒粒组建基因因组DNA物理理图谱基因组DNA同同源性研研究DNA杂杂交DNA序序列分析析一、限制制性内切切酶一、限制制性内切切酶（五）限限制性内内切酶的的活力单单位和星星号活力力1.酶活活力单位位2.星号号活力3.注意意事项1.酶活活力单位位在合适温温度、pH值和和离子强强度等条条件下，，1小时内完全全消化1μg特特异DNA底物物所需的的酶量，，定义为一个活活力单位位。（五）限限制性内内切酶的的活力单单位和星星号活力力一、限制制性内切切酶2.星号号活性限制性内内切酶在在非标准准反应条条件下，，对识别别序列的的特异性性下降，，能切割割一些与与特异识识别顺序序类似的的序列，，一般在在酶的右右上角加加“*”表示示克隆过程程中需同同时进行行双酶切切时，应应选用二二种酶都都能接受受的反应应缓冲体体系，否否则可能能影响酶酶的特异异性一、限制制性内切切酶3.注意意事项底物DNA不能能含有痕痕量的酚酚、氯仿仿和乙醚醚溶液中不不能含SDS和和过量的的盐，EDTA的含含量不能能大于10mmol/L一、限制制性内切切酶反应缓冲冲体系中中一般可可加入2-巯基基乙醇或或二硫苏苏糖醇，，防止含含巯基酶酶的氧化化失活加入牛血血清白蛋蛋白稳定定酶活性性操作时应应注意混混匀反应应体系一、限制制性内切切酶一、限制制性内切切酶2.Ⅱ类类限制－－修饰系系统3.甲基基化酶的的应用(六)甲甲基化化酶1.细菌菌的限制制－修饰饰系统(六)甲甲基化化酶1.细菌菌的限制制－修饰饰系统限制（降降解）外外来DNA，并并通过对对自身DNA的的修饰而起起保护作作用。一、限制制性内切切酶一、限制制性内切切酶2.Ⅱ类类限制－－修饰系系统由两种酶酶分子组组成的二二元系统统一种为限限制性内内切酶，，另一种种为甲基基化酶两种酶识识别序列列相同大肠杆菌菌株一般般有dam甲基基化酶和和dcm甲基化化酶（PstⅠ甲基化化酶使A甲基化化形成5′-CTGCmAG-3′）3.甲基基化酶的的应用当制备克克隆用双双链cDNA时时，外源源DNA片段可可用EcoRⅠ甲基化化酶处理理，使双双链cDNA内内部EcoRⅠ位点因甲甲基化受受到保护护而不被被切割一、限制制性内切切酶二、DNA连接接酶催化双链链DNA中相互互邻近的的5′磷磷酸末端端和3′′羟基末端端生成磷磷酸二酯酯键，从从而封闭闭DNA双链中中的切口或或将二个个DNA分子连连接起来来。二、DNA连接接酶DNA连连接酶只只能作用用于双链链DNA分子而而不能将将二个单单链DNA分子子连接DNA连连接酶是是重要的的基因重重组的工工具酶应用DNA连接接酶将具具有相同同粘性末末端或平平端的DNA分子连连接起来来DNA连连接酶的的特点：：T4噬菌体DNA连连接酶能能连接带带粘性末末端或平平末端的的DNA分子大肠杆菌菌DNA连接酶酶不能连连接平末末端DNA分分子DNA重重组技术术常用T4噬菌体DNA连连接酶二、DNA连接接酶T4噬菌体DNA连连接酶连连接带粘粘性末端端DNA分子的的效率远远高于连连接平末末端的DNA分分子连接反应应需要ATP、、Mg2+和二硫苏苏糖醇，，最适pH为7.2～7.4，，ATP为连接接反应提提供能量量，二硫硫苏糖醇醇可提高高连接效效率二、DNA连接接酶三、分子子克隆中中常用的的其他酶酶1.逆转转录酶2.TaqDNA聚聚合酶3.T4多核苷酸酸激酶4.末端端转移酶酶（脱氧氧核苷酸酸末端转转移酶））5.碱性性磷酸酶酶6.DNA聚合合酶Ⅰ7.Klenow片片段（DNA聚合酶酶Ⅰ大片段段）三、分子克克隆中常用用的其他酶酶1.逆转录录酶以RNA为为模板逆转转录合成cDNA2.TaqDNA聚合酶PCR扩增增目的DNA片段DNA序列列分析目的DNA片段3′′端加A，，用于A－－T克隆三、分子克克隆中常用用的其他酶酶3.T4多核苷酸激激酶催化多聚核核苷酸5′′端羟基磷磷酸化标记探针5′端4.末端转转移酶（脱脱氧核苷酸酸末端转移移酶）DNA片段段3′端加加上同聚物物尾标记DNA片段3′′端5.碱性磷磷酸酶去除多聚核核苷酸5′′端磷酸基基团6.DNA聚合酶ⅠⅠ合成双链DNA分子子缺口平移法法，获得高高比活性探探针DNA序列列分析补平3′端端三、分子克克隆中常用用的其他酶酶7.Klenow片片段（DNA聚合酶酶Ⅰ大片段段）具有完整的的DNA聚聚合酶活性性保留3′→→5′外切切酶活性无5′→3′外切酶酶活性三、分子克克隆中常用用的其他酶酶Klenow片段的的主要应用用：合成cDNA第二链链补齐双链DNA分子子3′端或或标记3′′端DNA序列列分析三、分子克克隆中常用用的其他酶酶第二节常常用载载体载体（vector）的概念念携带靶DNA（目的的DNA））片段进入入宿主细胞胞进行扩增和表表达的运载载工具。第二节常常用载载体第二节常常用用载体常用的载体体主要有：：质粒载体、、噬菌体载载体、病毒毒载体和人人工染色体体等根据其用途途不同分为为：克隆载体（（cloningvector）表达载体（（expressingvector）载体构建和和选择的条条件：1.自主复复制能力或或能整合到到宿主染色色体上与基基因组一同复复制的能力力2.合适的的限制性酶酶切位点供供外源DNA片段插插入3.分子量量不宜过大大，以便于于容纳较大大的外源DNA片段并获得得较高的拷拷贝数第二节常常用用载体第二节常常用用载体4.常用的的筛选标记记有抗药性性、酶基因因、营养缺陷型或形形成噬菌斑斑的能力等等5.配备与与宿主相适适应的调控控元件，如如启动子、增强子子和前导序序列等第二节常常用用载体二、噬菌体体载体三、穿梭载载体四、人工染染色体一、质粒载载体一、质粒载载体质粒载体是是应用最广广的载体质粒载体大大多是在天天然松驰型型质粒的基基础上经人工改造拼拼接而成质粒在宿主主蛋白质合合成及染色色体复制停停止后尚能继续复制制理想质粒载载体的特点点：1.松驰型型复制子（（如ColE1）复制子（replicon））为质粒自自我增殖所所必需2.几个单单一的酶切切位点（或或多克隆位位点）以便目的DNA片段段插入一、质粒载载体一、质粒载载体3.插入失失活的筛选选标志具有两种抗抗生素抗性性标志，如如氨苄青霉霉素抗性基因（Ampr）和四环素素抗性基因因（Tetr）等。4.分子量量相对较小小和拷贝数数较高5.缺点：：容量较小小，一般只只能接受小小于15kb的DNA一、质粒载载体（一）pBR322质粒载载体（二）pUC质粒粒载体系列列（一）pBR322质粒载载体pBR322载体是是最早被广广泛应用克克隆的载体体之一pBR322载体的的组成：来源于ColE1的的派生质粒粒pMB1的复制起起始位点来源于pSF2124质粒易易位子Tn3的Ampr来源于pSC101质粒的Tetr一、质粒载载体pBR322质粒载载体的特点点：1.带有一一个复制起起始点（ori）2.抗生素素抗性基因因（Ampr和Tetr）作选择标标志3.数数个个单单一一的的限限制制性性酶酶切切位位点点一、、质质粒粒载载体体4.较较小小的的分分子子量量易于于自自身身DNA的的纯纯化化，，而而且且能能有有效效地地克克隆隆6kb大小小的的外外源源DNA片片段段。。5.较较高高的的拷拷贝贝数数每个个细细胞胞达达1000～3000个个拷拷贝贝。。一、、质质粒粒载载体体一、、质质粒粒载载体体rrpBR332质质粒粒结结构构示示意意图图（二二））pUC质质粒粒载载体体系系列列在pBR322基基础础上上改改建建而而成成一、、质质粒粒载载体体典型型的的pUC质质粒粒载载体体有有4个个组组成成部部分分：：来自自pBR322质质粒粒的的复制制起起始始点点Ampr基因因大肠肠杆杆菌菌ββ-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因（（LacZ））启启动动子子及及编编码码αα-肽肽链链的的DNA序序列列（（LacZ′′基基因因）多克克隆隆位位点点（位位于于LacZ′′基基因因中中靠靠近近5′′端端））一、、质质粒粒载载体体pUC系系列列的的优优越越性性最通通用用的的大大肠肠杆杆菌菌克克隆隆载载体体之之一一优点点具有有更更小小的的分分子子量量和和更更高高的的拷拷贝贝数数仅保保留留了了pBR322的的复复制制子子和和Ampr具有有来来自自大大肠肠杆杆菌菌LacZ操操纵纵子子的的LacZ′′基基因因，，适适应应于于组组织织化化学学筛筛选选重重组组体体一、、质质粒粒载载体体一、、质质粒粒载载体体rpUC18/pUC19质质粒粒载载体体结结构构二、、噬噬菌菌体体载载体体λ噬菌体载体体粘粒载体称柯柯斯质粒（cosmid）单链丝状噬菌菌体载体二、噬菌体载载体λgt10（（插入型）结结构二、噬菌体载载体Charon40（替替换型）结构构二、噬菌体载载体r粘粒载体pJB8结构二、噬菌体载载体M13mp18/M13mp19结结构三、穿梭载体体同时具有原核核和真核细胞胞的复制起始始点真核生物的克克隆载体常构构建成穿梭载载体，使其先先在大肠杆菌菌中扩增，再再转入真核细细胞若加上适当的的真核启动子子等元件，则则成为真核表表达载体，能能在真核细胞胞中表达插入入载体中的外外源基因三、穿梭载体体真核系统载体体还必需具备备适当的筛选选标记使用遗传缺陷陷型细胞株与与载体的基因因产物互补（（如TK基因因产物）抗新霉霉素基基因三、穿穿梭载载体（二））逆转转录病病毒载载体（一））SV40（猿猿猴病病毒））载体体（一））SV40（猿猿猴病病毒））载体体真核表表达载载体中中的调调控元元件大大都来来源于于SV40的调调控顺顺序和和复制制信号号用SV40DNA与外外源DNA构建建重组组子，，转染染细胞胞后允允许细细胞形形成含含外源源DNA的的病毒毒颗粒粒重组子子不包包装成成病毒毒颗粒粒，而而在细细胞中中复制制或整整合到到染色色体组组中三、穿穿梭载载体例：PSVK3质粒粒PSVK3是一一类广广泛适适用于于哺乳乳动物物细胞胞系表表达外外源基基因的的穿梭梭载体体。三、穿穿梭载载体PSVK3具有有下列列构件件：1.原原核系系统构构件：：复制子子和丝丝状噬噬菌体体复制制起始始位点点fl筛选标标志（（Ampr）启动子子（T7启动子子）2.真真核系系统构构件：：SV40复复制起起始点点SV40早早期启启动子子三、穿穿梭载载体3.RNA修饰饰信号号：SV40小小T抗抗原拼拼接信信号SV40早早期区区mRNApolyA加尾尾信号号4.多多克隆隆位点点：SV40启启动子子下游游有8个酶酶切位位点三、穿穿梭载载体三、穿穿梭载载体pSVK3质粒粒（二））逆转转录病病毒载载体逆转录录病毒毒载体体的特特点：：具有广广泛的的哺乳乳动物物细胞胞宿主主较大的的容量量，能能插入入7kb甚甚至更更大的的外源源基因因三、穿穿梭载载体病毒基基因组组自身身含有有完整整高效效的调调控元元件病毒可可通过过主动动感染染方式式进入入宿主主细胞胞，并并能有有效地地整合合到宿宿主染染色体体基因因组中中，与与染色色体一一起复复制、、长期期存在在逆转录录病毒毒作为为载体体需要要相应应的外外包装装，以以形成成完整整的体体系三、穿穿梭载载体逆转录录病毒毒载体体的局局限性性：逆转录录病毒毒载体体进入入细胞胞依赖赖于细细胞表表面的的受体体，并并且只只能感感染并并整合合到分分裂增增殖期期的细细胞装载容容量较较小，，仅8kb左右右可能存存在具具有复复制能能力的的野生生型病病毒三、穿穿梭载载体常用外外源DNA片段段取代代病毒毒中的的癌基基因，，即卸卸去其其致癌癌性，，称为为卸甲甲载体体（disarmedvector）。。三、穿穿梭载载体四、人人工染染色体体酵母人人工染染色体体（YAC）细菌人人工染染色体体（BAC）噬菌体体P1衍生生的人人工染染色体体（PAC）哺乳动动物人人工染染色体体（MAC）YAC主要要调控控元件件着丝粒粒：保保证染染色体体细胞胞分裂裂过程程中正正确分分配到子子代细细胞端粒：：防止止染色色体被被核酸酸外切切酶降降解复制起起始点点和限限制性性内切切酶位位点四、人工染色色体筛选标志：酵母中一般通通过色氨酸、、亮氨酸、组组氨酸或尿嘧嘧啶的合成基基因产物插入入失活而进行行筛选原核序列及调调控元件：包括大肠杆菌菌复制起始点点、Ampr基因等四、人工染色色体YAC作为载载体的主要特特点：酵母是单细胞胞真核生物，，培养方便酵母的真核细细胞转录系统统，有利于表表达真核生物物基因装载容量大，，可达Mbp水平四、人工染色色体DNA片段连连接到YAC载体的（两两）臂上形成成重组体，将将重组体通过过常规方法导导入酵母已广泛应用于于各种生物基基因组计划四、人工染色色体第三节DNA重组与与鉴定第三节DNA重组与与鉴定将不同来源的的DNA分子子进行特异地地切割获得的目的基基因或DNA片段与载体体连接重组的DNA分子导入相相应的宿主细细胞在宿主细胞中中进行无性增增殖DNA重组(DNArecombination)第三节DNA重组与与鉴定第三节DNA重组与与鉴定二、重组子的的筛选与鉴定定三、DNA序序列测定一、DNA重重组一、DNA重重组（二）重组DNA分子导导入宿主细胞胞（一）目的DNA片段与与载体的连接接平接法平端连接法人人工接接头法同聚体加尾连连接一、DNA重重组（一）目的DNA片段与与载体的连接接粘端连接法平端连接法一、DNA重重组2.平端连接接3.同聚体加加尾连接4.人工接头头连接（一）目的DNA片段与与载体的连接接1.粘性末端端连接1.粘性末端端连接（cohesiveendligation））DNA插入片片段与的载体体存在同源粘粘性末端同源粘性末端端包括相同一一种内切酶产产生的粘性末端和不同的的内切酶产生生的互补粘性性末端一、DNA重重组（一）目的DNA片段与与载体的连接接一、DNA重重组2.平端连接接(bluntendligation)DNA连接酶酶可催化相同同和不同限制制性内切酶切切割的平端之之间的连接。。一、DNA重重组载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目的基因一、DNA重重组3.同聚体加加尾连接适用于外源DNA片段与与载体均为平平末端或为不不匹配的粘性末端端用末端转移酶酶使一个DNA分子3′′端接上多聚聚A,另一个DNA片段3′端端接上多聚T，按A-T配对原则相连一、DNA重重组一、DNA重重组4.人工接头头连接将目的基因或或DNA片段段的两端接上上能够被某一一限制性内切切酶识别的DNA序列，，酶切后和载载体获得相同同的粘性末端端，再进行粘粘性末端的连连接。一、DNA重重组一、DNA重重组宿主细胞：原核细胞（大大肠杆菌）真核细胞(哺哺乳类动物细细胞、酵母和和昆虫细胞)重组DNA分分子导入宿主主细胞方式：：转化、转染和和感染（二）重组DNA分子导导入宿主细胞胞一、DNA重重组一、DNA重重组（二）重组DNA分子导导入宿主细胞胞1.重组DNA分子导入入原核细胞2.重组DNA分子直接接导入真核细细胞3.使用噬菌菌体或病毒将将重组DNA分子导入细细胞1.重组DNA分子导入入原核细胞将重组的DNA分子导入入细菌，使其其在细菌体内内扩增及表达的过过程称为转化(transformation)转化的方法可可分为CaCl2法和电穿孔法法一、DNA重重组细菌在生长过过程中，只有有某一状态的的细菌才能成为转化的接接受体，这种种细菌称为感感受态细菌感受态细菌表表面正电荷增增多，细胞壁壁和膜的通透性增加，有有利于DNA分子的吸附附与吸收一、DNA重重组当细菌处于0℃、二价阳阳离子低渗溶溶液中时，细细菌细胞膨胀成成球形，处于于感受态转化混合物中中的DNA形形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于于细胞表面，，在42℃℃短时间热冲冲击后DNA进入入细胞转化效率为每每微克DNA可获得105～106转化子CaCl2法一、DNA重重组电穿孔法（electroporation））即电击法，利利用高压脉冲冲，在细菌细细胞表面形成成暂时性的微孔孔，重组DNA从微孔孔中进入，脉脉冲过后微孔复原转化效率高，，每微克DNA可得到109～1010转化子一、DNA重重组将外源DNA直接导入真真核细胞的过过程称为转染（transinfection）常用的方法：：电穿孔法磷酸钙共沉淀淀法脂质体法DEAE-葡葡聚糖介导显微注射法等等2.重组DNA分子直接接导入真核细细胞一、DNA重组磷酸钙共沉沉淀法将被转染的的DNA和和正在溶液液中形成的的磷酸钙微微粒共沉淀淀后，磷酸酸钙和外源源性DNA形成沉淀淀颗粒附着着在细胞表表面，在钙钙、磷的诱诱导下通过过内吞作用用被细胞摄摄取。一、DNA重组脂质体法是一种人造造膜泡，它它带有正电电荷，与DNA或RNA上带带负电的磷磷酸基团结结合，形成成由阳离子子脂质包裹裹DNA的的颗粒。脂质体上剩剩余的正电电荷与细胞胞膜上的唾唾液酸残基基的负电荷荷结合，通通过二者的的融合将外外源基因导导入细胞。。一、DNA重组显微注射法法将外源基因因的重组体体通过显微微注射装置置直接注入入细胞核中中并进行表表达，但显微注射法法需要一定的的仪器和操操作技巧。。一、DNA重组3.使用噬噬菌体或病病毒将重组组DNA分分子导入细细胞重组DNA分子在体体外包装成成具有感染染能力的噬菌体或病毒颗粒粒，然后感感染适当的的细胞，这这种使用噬菌体或病病毒将重组组DNA分子导入入细胞的方方法为感染(infection)效率较高，，每微克可可得到107转化子一、DNA重组二、重组子子的筛选与与鉴定（二）根据据重组DNA的分子子生物学特特征进行鉴鉴定（一）根据据遗传学性性状进行筛筛选二、重组子子的筛选与与鉴定（一）根据据遗传学性性状进行筛筛选1.抗性性标志筛选选2.抗性性标志插入入失活筛选选3.α互补补筛选4.标志志补救筛选选（一）根据据遗传学性性状进行筛筛选1.抗性标标志筛选当带有完整整抗药性基基因的载体体转入无抗抗药性细胞胞后，凡转转入载体的的细胞都获获得了抗药药性，能在在含有相应应抗生素的的琼脂平板板上生长成成菌落，而而未被转化化的宿主细细胞不能生生长。二、重组子子的筛选与与鉴定2.抗性标标志插入失失活筛选选用含有两两个以上的的抗药基因因载体，外外源DNA片段插入入其中一个个基因，导导致这个基基因失活，，用两个含含不同抗生生素的平板板互相对照照，筛选含含重组DNA的菌落落。二、重组子子的筛选与与鉴定二、重组子子的筛选与与鉴定3.α互补补筛选含有编码LacZ基基因的调控控序列和N端146个氨基酸酸的编码序列列当宿主细胞胞含有β-半乳糖苷苷酶C端编编码序列时时，此酶的N端端序列与宿宿主细胞的的C端序列列互补，产产生具有活性性的β-