牛轮状病毒的分离鉴定和疫苗研究进展

我国牛轮状病毒的分离鉴定和疫苗研究进展摘要：本文对牛轮状病毒的分离鉴定和疫苗研制这两方面的研究进展做一综述。关键词：牛轮状病毒；犊牛腹泻；分离鉴定；疫苗；牛轮状病毒（BovineRotavirus，BRV）是引起牛传染性腹泻疾病的重要病原之一。自然条件下，不同品种、不同年龄的牛都均具感染性，但以犊牛主发。据报道，目前国内外发现的BRV均为A组或G5、G6、G8、和G10血清型。迄今国内已检测到的BRV均属于G6、G10血清型的，对BRV的研究多集中在毒株的检测和疫苗的研制方面，本文就此做以综述。分离鉴定1.1分离方法自1969年Mebus等[1]在电镜下观察到BRV并成功分离毒株以来，各国有关BRV分离方法的研究报告不断出现。我国在这方面的研究报道始于1984年，吴城等[2]从福建某县采集了25份患有BRV腹泻疾病的牛粪便，经处理接种于牛肾原代细胞，传代后细胞始终未出现典型病变。而次年刘纯荣等[3]应用MA-104细胞由耗牛病料分离出了4株轮状病毒。李昌仁等[4]1987年同样使用MA-104细胞成功的从黑龙江省腹泻犊牛粪便中分离出了4株BRV，命名为DNRV1、DNRV2、DNRV3、DNRV4。孙继国等[5]1996年对BRVNCDV株在MA-104、LLc-mk2和Hela三种细胞中的生长情况进行了比较研究，结果是在MA-104细胞上生长最好，HeLa细胞上不生长，在LLc-mk2细胞上虽然能生长，但无细胞病变。苏小康等[6]2005年应用Marc145细胞成功分离出了一株BRV。目前分离BRV所使用的细胞首选为MA-104细胞。它能够给BRV提供一个很好的增殖环境。1.2鉴定方法有关毒株的鉴定方法种类繁多，根据其各自的优缺点应用在不同的情况下。通常为了对分离株进行充分、系统的鉴定会同时采用一种以上的方法。现将常用、可靠的鉴定方法简介如下。1.2.1电镜法在BRV的检测中常用的电镜方法有直接电镜和免疫电镜两种。直接电镜法操作简单、结果可靠，但检出率受病毒粒子数量、完整性的影响，因此往往结合其他方法一同使用。免疫电镜比直接电镜敏感性更高，更易观察，检出率是直接电镜的10倍以上，并可同时检出不同的血清型。我国李决等[7]人1987年应用电子显微镜技术、PAGE和ELISA等方法，首次在河南的腹泻犊牛粪便中检测出了轮状病毒。后来又有关平原等[8]应用直接电镜和免疫电镜方法对腹泻犊牛的粪便、肠内容物进行检测，结果在两种病料中均见BRV粒子。证实了电镜方法用作BRV腹泻诊断是可行的。近年栾婧婧等[9]从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一株BRV，应用电镜技术较为系统的观察了病毒在宿主细胞中的形态结构变化和宿主的结构变化,丰富了BRV的鉴定依据。因电子显微镜具有极高的放大倍数，可使病毒粒子的形态结构清晰可见的特点，使其至今仍广泛应用在BRV的检测中。但电镜检测所需成本较高，不适于大量样品的检测。1.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）PAGE可将BRVRNA的11条带清晰的呈现在电泳图上，根据这11条带的分布进行A~G的分组，同时反映了病毒RNA基因组的差异和变异，现已检测到的BRV均为A组，其电泳条带呈4：2：3：2的特征分布。倪亚伟[10]1986年采用PAGE的方法对已分离出的四株BRV进行鉴定，结果电泳图谱呈现出BRV典型的11条带，进一步分析发现分离株BRV6576和BRV6555的第7、8、9三条带之间的距离具有明显差异。这为分子流行病学的调查提供了依据。付新成等[11]2009年从疑似轮状病毒腹泻犊牛粪便样品中提取病毒RNA，PAGE检测结果是6个样品中有4个样品的电泳条带呈现A组BRV特有的4∶2∶3∶2分布。由此证明该牛群存在A组BRV感染。PAGE作为BRV鉴定方法之一，具有特异性强，操作、设备简单等优点，但病毒的RNA易降解导致假阴性的结果出现。1.2.3早在1983年世界卫生组织已将ELISA列为诊断轮状病毒的标准方法。在我国有关这方面的报道最早见于1985年刘纯荣等[12]应用ELISA、ELISA阻断试验、免疫电镜、PAGE和细胞培养等方法对四川省耗牛进行检测。证实了BRV是四川耗牛腹泻的主要病原。类似的报道还有李决等[7]人和林雪等[13]人先后对河南地区犊牛粪便样品的检测时应用到了此方法。梅魁敏等人[14]应用该方法在江西省养牛业中检测到BRV的存在。2009年曹竹婷等[15]确定了间接ELISA检测牛血清中BRV抗体的最佳工作条件及判定标准，实验表明该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等特点，适合于对BRV特异性抗体的动态监测和批量检测。ELISA不仅适用于临床标本的抗原、抗体的检测，也适合于进行大规模样品的检测，开展流行病学调查。除具有灵敏、特异、简单、快速、稳定等特点还易于自动化操作。1.2.4RT-PCRRT-PCRRT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术。分为两步，先以RNA为模板合成cDNA，之后以cDNA为模板进行PCR反应。近年来国内外多采用该方法鉴定未知毒株。敏感性可达到1pg水平，有很强的特异性和可重复性。栾婧婧等[16]2006年建立了半巢式RT-PCR快速检测犊牛轮状病毒的方法，该方法设计了针对BRVVP7基因和BRVG6血清型的两种特异性引物，根据特异性扩增结果鉴定毒株。实验结果表明该方法具有较好特异性、敏感性。在快速诊断BRV腹泻疾病的同时又鉴定了该病毒属于G6血清型的。常继涛等[17]2008年采集了内蒙古、黑龙江、新疆、北京、安徽等地犊牛腹泻粪便样品，对其中11份PAGE检测阳性者，采用半巢氏多重PCR的方法进行了G血清型的鉴定。结果是其中4份为国内已有的G6血清型，另外7份为国内从未检测到的G10血清型。将这11份样品接种到MA104细胞上，最终仅分离到一株病毒，采用半巢氏多重PCR的方法对其进行G、P血清型的鉴定，结果是该分离株血清型为G10P[11]的，命名为HM26。鉴于目前BRV与其他致牛腹泻病原体的混合感染,我国学者建立了能同时检出多种牛腹泻病原体的方法。如张俭伟等[18]在2008年建立了能够同时检测牛轮状病毒(BRV)与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的双重RT-PCR方法，降低了检测成本和检测时间。次年柳强等[19]根据GenBank中牛冠状病毒（BCV）、BRV核苷酸序列，分别设计并合成了两对特异性扩增BCV、BRV的引物，优化了PCR反应条件，最终建立了可以同时检测这两种病原的双重RT-PCR方法。随后，在对多种病毒进行扩增时仅有BCV、BRV出现大小分别为244bp和382bp的特异性条带，表现出极高的特异性。另外对BCV和BRV检测的敏感度分别为1个和100个TCID50/100μL。1.2.5核苷酸序列测定核酸序列测定是指是通过化学方法测定DNA片段中的核苷酸排列顺序的技术，是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上建立起来的，可分辨出不同序列之间仅一个碱基的差别，适合于同源序列之间的分析比较。近年国内外开始将其应用到BRV的鉴定中。我国应用此项技术检测BRV的报道较少。栾婧婧等[20]2006年从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一毒株，通过RT-PCR扩增该毒株的保护性抗原VP7基因，扩增产物连接到载体后进行序列测定，在Genebank中进行同源性检索,发现该序列与RF株和轮状病毒标准株NCDV的同源性分别为98.9%和98.3%。与已发表的G6血清型轮状病毒的VP7基因序列的同源性在84.7%~99.06%之间。由此可见,该分离毒株为G6血清型BRV。次年姜向阳等[21]从疑似轮状病毒腹泻犊牛粪样中分离到一株牛轮状病毒。通过RT-PCR的方法扩增VP1基因，连入载体并测序，经DNAStar软件分析,可知分离株的VP1基因与RF株和UK株的核苷酸同源性分别为98.9%和95%,证明分离毒株是一株牛轮状病毒。2疫苗的研究BRV腹泻同其他病毒性疾病一样,均无特效疗法。因此，接种疫苗是预防本病的最佳方法。早在1973年USDA（）美国农业部批准了第一个新生犊牛轮状病毒口服减毒疫苗用于免疫预防，时至今日，本病疫苗的研制仍为人们探讨和研究。目前多数研究集中于BRV弱毒疫苗和灭活疫苗作产前免疫这两个方面。现就我国疫苗的研究现状介绍如下。2.1弱毒活疫苗弱毒活疫苗系利用人工致弱或天然弱毒的毒株制成的疫苗。这类疫苗的特点是用量少、免疫力产生快且坚强；由于制苗之种毒为活毒，接种后可与于体内增殖，故存在变异——毒力变强，即“返祖”的危险；同时也存在免疫机体排毒可能。因此，在弱毒活疫苗的研制中需要对其安全性倍加关注。1993年我国的林继煌等[22]人用BRV014株的高代细胞培养物对产前3个月和1个月的黄牛进行两次免疫，每次肌注10ml，同时设立对照。利用反向间接血凝抑制(RIHI)试验测定受试牛的血清和初乳之BRV抗体的变化，检测结果是二者滴度均为免疫组高于对照组，且差异显著。抗体持续期免疫组为13天，而对照组仅有5天。本研究还对所产犊牛的腹泻发生率进行了统计，结果是免疫组腹泻发生率只有10.8%，而照组则高达57.1%；在病情和病程表现上也是前者较后者轻微，短暂。该研究为我国的BRV弱毒活疫苗的研制首开先河，为后续弱毒活疫苗的研制提供了参考。但此项工作未测接种疫苗的病毒滴度和病毒的排出率，因此做为疫苗的安全问题留有悬笔。何孔旺等[23]1998年同样用BRV014株的高代次(50代以上)细胞培养物(TCID50=10-6.5)于孕牛产前3个月和1个月经肌肉各免疫注射21次，每次肌注次8~10ml，同时设立对照。利用RIHI试验测定受试牛的结果可明显提高母牛初乳中的特异性BRV抗体的变化,检测结果是免疫组初乳中抗体滴度最高可达1：4096，并且在直到产后20d抗体滴度仍能维持在1∶64，。这与对照组有显著差异。抗体持续期免疫组为16天，而对照组仅有3天。此外对所产犊牛腹泻发生率的统计临床观察,显示，免疫2次的母牛所组所产犊牛的腹泻发生率较对照组降低83.8%。以上研究为说明该高代次细胞培养物作为BRV弱毒活疫苗的研制提供了候选毒株具有良好应用前景。基于我国BRV主要流行的血清型有G6、G10两种，因此研制多价（二价）疫苗更具应用价值。而且BRVRNA分11节段，可利用生物重组技术获得基因重配的减毒活疫苗。常继涛等[24]2009年借鉴人轮状病毒的研究平台，以羊轮状病毒LLR-85毒株（G10）和BRVNCDV毒株（G6）为亲本，构建出一株具有G6血清型的，对牛天然弱毒的基因重配毒株，并命名为R191，其VP7基因来源于NCDV株，其余的10个基因节段来源于LLR-85毒株，以R191毒株与和LLR-85毒株制成的二价减毒疫苗涵盖了BRVG6和G10我国BRV主要流行的血清型的二价减毒疫苗。经田间试验表明该疫苗具有良好的免疫原性和较低的病毒释放率。可作为预防BRV多价弱毒活感染的疫苗的候选毒株研制提供了参考。BRVRNA分11节段，便于通过生物技术手段获得基因重配株。将来随着新血清型的出现，运用该方法可以很容易制得包含新血清型的多价弱毒活疫苗，实现对BRV腹泻疾病及时、全面的预防。2.2灭活疫苗灭活疫苗系选用标准强毒株或免疫原性特别好的弱毒株，经人工培养，用化学或物理方法杀死（灭活）后制成，至今常用的灭活方法是用甲醛等化学试剂灭活。这类疫苗较弱毒活疫苗安全性高，但免疫原性差，使用时一般要加佐剂以提高其免疫原性。灭活疫苗是利用理化方法甚至简单加热使病毒失去增殖能力后制成的一种安全性较高的疫苗。虽能引起免疫反应，但其部分抗原成分被破坏，故免疫力差，在使用时一般要加入佐剂提高免疫原性。我国有关BRV灭活疫苗的研究开展较晚，报道较少。张俭伟等[25]2007年将BRVCHLY株（TCID50=10-6.59）按常规方法制成油乳佐剂灭活疫苗。对产前2个月和1个月的荷斯坦牛进行两次免疫，每次3ml，同时设立对照。用间接ELISA、中和试验测定受试牛之乳清和所产犊牛血清中BRV抗体的变化。选取12头同期发情配种的荷斯坦孕牛，随机平均分为免疫组和对照组，免疫组在产前2月和1月分两次免疫该疫苗，每次注射3ml，对照组不做任何免疫。采集母牛分娩后的第1、2、3、4、6、8、10、14和21天的牛乳和犊牛血清。用间接ELISA、中和试验检测乳清和血清中BRV抗体。结果,是在检测期间对照组乳清中特异性IgG、IgA及中和抗体效价均小于200。而免疫组母牛乳清中及其所产犊牛血清中特异性IgG、IgA及中和BRV抗体效价分别在第1d1天和第2天达到了最大值，然后随时间的延长逐渐降低。，而对照组其效价一直处于较低水平，两组差异极显著在犊牛血清检测中对照组特异性抗体均小于200，免疫组特异性抗体在第2d上升到最大值。表明犊牛可从初乳中吸收BRV特异性抗体,显著提高血清中的特异性抗体水平。本研究还进行了攻毒实验，结果是免疫组所产犊牛的发病率较对照组所产犊牛低，潜伏期也是前者长于后者用2ml106.59TCID50/ml的BRVCHLY株对21日龄犊牛攻毒,。证实了该疫苗对犊牛腹泻有保护作用。此研究以上为灭活疫苗的研制奠定了理论基础。[26]又于2008年次年又以同一毒株，按常规方法制备油乳佐剂疫苗和铝佐剂疫苗，比较不同佐剂疫苗的免疫原性。免疫小鼠和怀孕的新西兰兔。ELISA检测小鼠、怀孕的新西兰兔在免疫前后血清中特异性抗体的变化和仔兔血清中特异性抗体的滴度。结果证明了是两种疫苗均具有良好的免疫原性。但其对犊牛的保护作用还有待研究。同年曹竹婷等[27]做了类似的研究，结果是免疫组动物2008年用终浓度为0.1%的甲醛灭活BRV山东分离株CHLY（G6血清型），并按常规方法制成油乳剂灭活疫苗。田间试验分为两组，其中一组实验对3月龄内的90头犊牛随机分组免疫，另一组对30头怀孕牛在产前30~90天一免，两周后二免。免疫后30天内该疫苗没有因注射该疫苗对实验动物而产生副作用，证实了该疫苗的安全性。用已建立的间接ELISA和中和试验对免疫后组犊牛血清中和牛初乳中的特异性抗体和牛初乳中特异性抗体水平进行检测较对照组有显著提高，证实了该疫苗具有很好的免疫原性。3结束语BRV的危害一直未能杜绝根除，而且愈演愈烈，影响了养牛业的发展，因此，人们一直以来不断对他进行研究，除本文所提到上述的分离鉴定和疫苗的研究外还有许多方面也在积极的研究中，例如：单克隆抗体的制备、流行病学和的研究和结构功能。。。。。。等的研究。参考文献：[1]MebusCA.UnderdahlNR,RhodesMB,etal.Calfdiarrhoeareproducedwithavirusfromafieldoutbreak[M].Bulletin:UniversityofNebraskaAgriculturalExperimentStationResearch,1969:233.[2]吴城，金学浩，曾广谧等.福建省牛流行性腹泻病原一牛轮状病毒的研究[J].畜牧兽医学报，15（4），249-256.[3]刘纯荣，陈晓兰，刘琦等.用细胞培养分离耗牛轮状病毒[J].中国人兽共患病杂志，（10），57-58.[4]李昌仁，王君伟，李英霞等.黑龙江省犊牛腹泻粪便中轮状病毒的分离与鉴定[J].东北农学院学报，21（1），51-56.[5]孙继国，郑世学，刘美红.犊牛腹泻轮状病毒在3个传代细胞上培养特性的研究[J].河北农业大学学报，19（1），59-63.[6]苏小庚，吴周良，王正秀.犊牛轮状病毒的分离鉴定[J].河北农业大学学报，28（4），93-100.[7]李决，林雪.在犊牛腹泻粪便中检出轮状病毒[J].郑州牧专学报，（1），24-25.[8]关平原，郭延春.应用直接透射电镜配合免疫电镜诊断牛轮状病毒性腹泻[J].中国兽医杂志，15（12），8-9.[9]栾婧婧，杨少华，马广强.新分离牛轮状病毒及其血清型的研究[J].家畜生态学报，27（6），141-144.[10]倪亚炜.猪和牛轮状病的分离与鉴定[J].病毒学报，2（1），36-40.[11]付新成，李聪研，张艳玲等.聚丙烯酰胺电泳检测犊牛轮状病毒[J].动物保健，（17），38-39.[12]刘纯荣，刘琦，陈晓兰等.耗牛腹泻病原-轮状病毒的调查[J].中国兽医科技，（10），19-21.[13]林雪，包文奇，李决.应用聚丙烯酞胺凝胶电泳检测牛、猪轮状病毒试验[J].河南农业科学，（9），33-34.[14]梅魁敏，伍学州，范青生.用ELISA法和核酸电泳法检测牛轮状病毒[J].徽生物学通报，18（6），366-367.[15]曹竹婷，杨少华，杨宏军.检测牛轮