免疫细胞及其功能检验技术

免疫细胞及其功能检验技术第一页，共五十一页，2022年，8月28日第二十三章

免疫细胞及其功能检验技术第二页，共五十一页，2022年，8月28日单个核细胞和淋巴细胞及其亚群的分离纯化原理。T细胞及其亚群的表面标志和功能检测。B细胞功能检测的方法和原理。NK细胞的表面标志及其功能检测方法。中性粒细胞和巨噬细胞的功能检测。本章要点第三页，共五十一页，2022年，8月28日目录免疫细胞的分离与纯化1淋巴细胞数量及功能检测2吞噬细胞功能检测3第四页，共五十一页，2022年，8月28日免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，主要包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞和树突状细胞等。通过分离、纯化免疫细胞及其亚群，并对其数量和功能测定，可以判断机体免疫功能状态，对指导临床实践和科学研究具有重要意义。前言第五页，共五十一页，2022年，8月28日第一节免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离方法很多，主要根据细胞表面标志、理化性状和细胞功能等特征。应根据实验目的、所分离的目的细胞群种类、数量和纯度等要求选择分离方法。所用的方法应力求操作简便、尽量保持细胞活性兼顾细胞纯度和获得率。第六页，共五十一页，2022年，8月28日一、白细胞的分离（一）自然沉降法加抗凝血于试管中室温或37℃中静置（30-60min）分层结果示意图第七页，共五十一页，2022年，8月28日（二）高分子聚合物沉降法抗凝血与等量3%明胶或6%右旋糖酐溶液混匀室温或37℃中静置（30～60min）分层结果与自然沉降法类似优点：速度快、得率高不足：白细胞黏性增加第八页，共五十一页，2022年，8月28日二、外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）主要是指淋巴细胞和单核细胞。PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。第九页，共五十一页，2022年，8月28日细胞种类密度红细胞1.093白细胞1.092淋巴细胞和单核细胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各类血细胞密度常用的分离液：Ficoll液和Percoll液尤以密度为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分层液（Ficoll液）最常用。第十页，共五十一页，2022年，8月28日（一）

Ficoll分离法注意：温度以20℃最适宜，超过25℃影响细胞得率第十一页，共五十一页，2022年，8月28日（二）

Percoll分层液法连续密度梯度分离液（Percoll液+PBS，离心）加入PBMC悬液或抗凝全血1000×g离心20min结果示意图第十二页，共五十一页，2022年，8月28日三、淋巴细胞的纯化及亚群的分离采用Ficoll和Percoll分离法获得的细胞悬液成分仍然较为复杂、均一性不佳。通常需要进一步分离纯化淋巴细胞及其亚群。分离原理主要基于细胞的表面标志和功能等性质。淋巴细胞及其亚类的分离纯化是免疫学检验与研究的重要基础技术。第十三页，共五十一页，2022年，8月28日（一）淋巴细胞的纯化去除红细胞：低渗裂解法、氯化铵裂解法。去除血小板：多次洗涤离心法、胎牛血清梯度离心法。去除单核细胞：黏附法、羧基铁吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法第十四页，共五十一页，2022年，8月28日（二）淋巴细胞的分离E花环沉降法该法简便易行，主要用于T细胞的分离PBMC悬液与SRBC混合Ficoll法密度梯度离心收集管底细胞并低渗裂解第十五页，共五十一页，2022年，8月28日（二）淋巴细胞的分离尼龙棉分离法该法简单快速，可分离T细胞和B细胞PBMC悬液加入尼龙棉柱37℃中静置1～2小时预热的含小牛血清培养液洗脱获得T细胞冷培养液边冲洗边挤压获得B细胞第十六页，共五十一页，2022年，8月28日（二）淋巴细胞的分离免疫磁珠分离法第十七页，共五十一页，2022年，8月28日（二）淋巴细胞的分离流式细胞术分离法该法快速、细胞纯度和获得率高，可分离各种淋巴细胞及其亚群。第十八页，共五十一页，2022年，8月28日四、吞噬细胞的分离吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中性粒细胞。分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。第十九页，共五十一页，2022年，8月28日（一）单核细胞的分离Percoll密度梯度分离法流式细胞术分离法（常用方法）免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法）黏附法黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除单核细胞。第二十页，共五十一页，2022年，8月28日（二）巨噬细胞的分离斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞）

操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞）

操作要点：少量液体石蜡注入动物腹腔内，3~4天后冲洗出腹腔渗出液（70%~80%为巨噬细胞）。第二十一页，共五十一页，2022年，8月28日（三）中性粒细胞的分离右旋糖酐沉降法：

操作要点：抗凝静脉血与6%右旋糖酐溶液按比例混合，室温条件垂直静置一定时间后，红细胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白细胞沉降速度慢位于上层，获取上层细胞。第二十二页，共五十一页，2022年，8月28日第二节淋巴细胞数量及功能检测许多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴细胞数量和功能变化。数量检测：根据淋巴细胞及其亚群的表面标志。功能测定：包括体内试验和体外试验。第二十三页，共五十一页，2022年，8月28日一、T细胞数量及功能检测（一）T细胞的数量检测根据T细胞表面CD分子检测：（1）间接荧光免疫法（2）免疫组织化学法：①酶标（ABC法、APAAP法）②金标法（即IGSS法）第二十四页，共五十一页，2022年，8月28日间接荧光免疫法第二十五页，共五十一页，2022年，8月28日（二）T细胞功能检测T细胞增殖试验：形态学法、3H-TdR掺入法、MTT法CTL介导的细胞毒试验：51Cr释放法抗原特异性T细胞定量检测：MHC-抗原肽四聚体技术淋巴细胞内细胞因子检测：流式细胞术体内试验：结核菌素试验、PHA皮肤试验第二十六页，共五十一页，2022年，8月28日PBMCPHA5％CO2、

37℃培养72h细胞涂片染色显微镜检查该法简便易行、容易在基层推广，但主观因素影响大。形态学法T细胞增殖试验第二十七页，共五十一页，2022年，8月28日未转化淋巴细胞转化的淋巴母细胞转化率（％）＝转化的淋巴细胞数计数的淋巴细胞总数X100％第二十八页，共五十一页，2022年，8月28日培养液3H-TdRPHA淋巴细胞抗凝全血分离液离心过滤测量放射性3H-TdR掺入法灵敏度高客观性好第二十九页，共五十一页，2022年，8月28日原理：外周血T细胞

PHA发生增殖

MTT含蓝色甲颗粒的T细胞

MTT

PHA有机溶剂测吸光度（A）值

计算SI判定细胞增殖结果(SI≧2具有意义)MTT法操作简便无放射污染第三十页，共五十一页，2022年，8月28日51Cr释放法淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定γ射线CTL介导的细胞毒试验第三十一页，共五十一页，2022年，8月28日原理根据T细胞活化的双识别原理，用生物工程技术将MHC分子在体外组装，并结合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子复合物，结合流式细胞仪定量检测抗原特异性T细胞。TMHC-抗原肽四聚体技术第三十二页，共五十一页，2022年，8月28日MHC-肽四聚体技术第三十三页，共五十一页，2022年，8月28日第三十四页，共五十一页，2022年，8月28日淋巴细胞内细胞因子检测实验原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑制剂如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪测定淋巴细胞内的细胞因子种类，确定Th1/Th2细胞的百分率。第三十五页，共五十一页，2022年，8月28日分泌的细胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++Thl和Th2分泌的细胞因子第三十六页，共五十一页，2022年，8月28日二、B细胞数量及功能检测（一）B细胞数量检测根据B细胞表面标志进行检测：（1）mIg的检测：免疫荧光、免疫组化（2）

CD分子的检测：检测CD19、CD20、CD21、CD22、

CD29以及CD5等（3）小鼠红细胞受体的检测：花环试验第三十七页，共五十一页，2022年，8月28日（二）B细胞功能检测B细胞增殖试验：3H-TdR掺入法、MTT法（刺激物：小鼠用LPS；人用SPA的金黄色葡萄球菌菌体或抗IgM抗体）B细胞抗体产生能力检测：溶血空斑试验、ELISPOT第三十八页，共五十一页，2022年，8月28日经典溶血空斑试验1.SRBC致敏的B细胞与SRBC在凝胶介质中混匀；2.抗体形成细胞(Antibodyformingcell,AFC)周围的SRBC与AFC产生的抗体结合而被致敏；3.加入豚鼠新鲜补体，致敏SRBC激活补体而溶解，在AFC周围出现肉眼可见的溶血空斑；4.计算溶血空斑的数目。第三十九页，共五十一页，2022年，8月28日溶血空斑试验第四十页，共五十一页，2022年，8月28日酶联免疫斑点试验抗体产生B细胞抗原包被酶联抗抗体凝胶底物显色可在单细胞水平上检测B产生抗体和T细胞分泌细胞因子第四十一页，共五十一页，2022年，8月28日三、NK细胞数量及功能检测（一）NK细胞数量检测根据NK细胞表面标志进行检测：

CD分子的检测：检测CD3、CD56、CD16等（CD3-CD56+CD16+）

第四十二页，共五十一页，2022年，8月28日（二）NK细胞功能检测形态学法酶释法：LDH释放法荧光法：时间分辨荧光免疫分析法放射性核素释放法：51Cr释放法、125I-UdR释放法流式细胞术：PI染色NK靶细胞检测荧光强度、cpm等K562细胞为人NK细胞杀伤功能检测的常用靶细胞第四十三页，共五十一页，2022年，8月28日第三节吞噬细胞功能检测一、中性粒细胞功能检测趋化功能检测：体内法（也称皮肤窗口法）体外法（滤膜渗透法/

Boyden小室法、琼脂糖平板法）吞噬功能检测：（吞噬金黄色葡萄球菌或白色念珠菌）杀伤功能检测：

溶菌法、硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验第四十四页，共五十一页，2022年，8月28日体内实验法--皮肤窗口法在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3小时后开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。（一）中性粒细胞趋化功能检测第四十五页，共五十一页，2022年，8月28日体外法--Boyden小室法Boyden小室第四十六页，共五十一页，2022年，8月28日体外法--琼脂糖平板法原理及