西安制造国家实验室申请

实验22食品氨基酸酸含量的测定实验学时：10实验类型：综合性实验实验目的为了提高实验课的教学效果，提高学生实验动手能力、综合实验能力以及实际应用能力，对“食品工程专业”学生，在原有实验课的基础上，开设“食品氨基酸含量的测定”综合大实验。测定氨基酸的方法有甲醛滴定、茚三酮比色、电位滴定、气相、液相、薄层、离子交换色谱、自动分析仪等；本实验分别使用甲醛滴定（单双指示剂法）、茚三酮比色和电位滴定等方法测定了酱油中的氨基酸态氮的含量，即可得出酱油中总氨基酸的含量。通过本实验，强化学生动手实践的能力，为毕业后能够更好的使理论知识应用到实践中作初步准备。1.单指示剂甲醛滴定法实验原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基，而-COOH基显示酸性，又含有-NH2，-NH2则显示碱性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐，当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式以三种形式存在。用碱完全中和-COOH基时的pH值为8.4~9.2。实验仪器设备：烧杯、碱式滴定管和滴定台等试剂配制1.40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，将甲醛用1NNaOH溶液中和（淡蓝色）;2.0.1%百里酚酞乙醇溶液;3.0.100N

NaOH标准溶液;实验操作称取一定量酱油样品(约含20mg左右的氨基酸)→于烧杯中→加两滴指示剂→用0.1NNaOH溶液滴定到淡蓝色→加中性甲醛20mL→摇匀→静置1分钟→此时蓝色应消失→再用0.1NNaOH溶液滴定至淡蓝色，记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。

计算：氨基酸态氮=（N×V×0.014×100）/W×100%式中：N：NaOH标准溶液当量浓渡；V：NaOH标准溶液消耗的总量(mL)；W：样品溶液相当样品重量(g)；0.014：氮的毫克当量；2.双指示剂甲醛滴定法实验原理：与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂，从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法（此法操作复杂，但准确，不作介绍）相近，单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液的pH值作为中性红的终点，pH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法比单色滴定法准确。实验仪器设备：同单指试剂滴定相同。试剂配制1.三种试剂同单指示剂法；2.0.1％中性红(50％乙醇溶液)；实验操作取相同两份酱油样品→分别于100mL烧杯中→一份加中性红2滴→用0.1NNaOH滴定终点（由红变琥珀色），记录用量；另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20mL→摇匀→用0.1NNaOH

滴至淡蓝色。

计算：氨基酸态氮=（N×（V2-V1）×0.014×100）/W×10V1：用中性红为指示剂时，碱液所消耗的体积；V2：用百里酚酞乙醇液为指示剂时，标液消耗量；0.014：氮的毫克当量浓度；

注意事项1.单色指示剂甲醛滴定法，用碱完全中和—COOH基时的pH为8.5~9.5；2.测定时样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定；3.茚三酮比色法实验原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可以用吸光光度法测定。反应式如下：蓝紫色化合物亮黄色化合物水合茚三酮还原茚三酮该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。实验仪器设备容量瓶、烧杯、水浴锅、分光光度计等试剂配制磷酸缓冲液（pH8.04）制备方法如下：⑴称磷酸二氢钾4.5350g。定容500mL；⑵称Na2HPO4·12H2O11.9380g分别溶解定容500mL；⑶取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04缓冲液；2.2%茚三酮溶液：称茚三酮1g→溶于35mL热水→加入40mg氯化亚锡（SnCl2·H2O）搅拌过滤（作防腐剂）→于冷暗处过夜→定容50mL氨基酸标准液

称干燥氨基酸（如异亮氨酸0.2000g）→溶解定容100mL→摇匀→吸10mL于另外100mL容量瓶,定容100mL，即得200μg/mL标液

实验操作1.绘制标准曲线：

取7个25mL容量瓶，吸取标液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL于7个25mL容量瓶，加水补充至容积为4mL，然后加茚三酮和缓冲液各1mL，于水浴加热15分钟，冷却后定容25mL，静置15分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线。2.样品测定：

取酱油样5~10mL→于烧杯中→加50mL水和活性碳约5g→加热过滤→用30~40mL热水洗涤活性炭→吸澄清样液1~4ml→加茚三酮和缓冲液各1mL水浴加热15分钟，冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100

C：从标准曲线上查得得氨基酸的量（μg）；

W：测定得样品溶液相当于样品的量（g）；

注意事项茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：

取10g茚三酮容于40mL热水中，加1g活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2mL冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。

3.电位滴定法实验原理：根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极（或复合电极）插入被测液中构成电池，用碱液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。实验仪器设备：酸度计，磁力搅拌器，烧杯（250mL），微量滴定管

试剂配制pH=6.18标准缓冲溶液；20%中性甲醛溶液；0.05mol/L左右的NaOH标准溶液；

实验操作1.样品处理

准确吸取酱油5.00mL于100mL容量瓶中，加水定容。混匀后吸取定容液20.00mL，置于250mL烧杯中，加水60mL，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。用pH=6.18的标准缓冲液校正好酸度计，然后将电极清洗干净，再插入到上述酱油液中，用NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记下消耗的NaOH溶液体积。2.氨基酸的滴定在上述滴定至pH=8.2的溶液中准确加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定至pH=9.2，记下消耗的NaOH溶液体积，供计算氨基酸态氮含量用。3.空白滴定

吸取80mL蒸馏水于250mL的烧杯中，用NaOH标准溶液滴定至pH=8.2，然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH=9.2，记下加入甲醛后消耗的NaOH溶液体积。

计算ρ=[(V1-V2)×C×0.0141]／5×(V3／100)

式中：ρ：样品中氨基酸态氮的含量，g/100mL；

V1：酱油稀释液加入甲醛后滴定至pH=9.2所用NaOH标准溶液的体积，mL；

V2：试剂空白滴定加入甲醛后滴定至pH=9.2所用NaOH标准溶液的体积mL；

V3：样品稀释液取用量，mL；

C：NaOH标准溶液的浓度，mol/L；

0.014：1.000mol/L氢氧化钠标准溶液相当氮的